基础研究
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世界华人消化杂志. 2021-08-28; 29(16): 934-944
Published online 2021-08-28. doi: 10.11569/wcjd.v29.i16.934
HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定
邱华, 林栋毅, 李锦源
邱华, 林栋毅, 李锦源, 广西医科大学附属肿瘤医院 广西壮族自治区南宁市 530021
邱华, 教授, 研究方向为HBV感染相关肝癌、肝硬化的基础与临床研究.
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. 81860889、No.81660827; 中国博士后科学基金面上项目, No. 2019M653312; 广西自然科学基金面上项目, No. 2020GXNSFAA297113; 第二批广西高层次骨干人才培养139计划(桂卫科教发[2018]22号); 广西科技厅重点研发项目, No. 2017AB45166.
作者贡献分布: 此课题由邱华设计; 研究过程由邱华、林栋毅及李锦源操作完成; 数据分析由邱华, 林栋毅完成; 本论文写作由邱华、林栋毅完成.
通讯作者: 邱华, 教授, 博士, 博士后, 530021, 广西省南宁市青秀区河堤路71号, 广西医科大学附属肿瘤医院. qiuhua8899@163.com
收稿日期: 2021-05-28
修回日期: 2021-06-16
接受日期: 2021-07-07
在线出版日期: 2021-08-28
文章亮点
实验背景

慢性乙型肝炎的抗病毒治疗已进入到要实现"临床性治愈""完全治愈"的新时代. 已知共价闭合环状DNA分子(covalently closed circularDNA, cccDNA)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是导致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染慢性化和难以治愈的关键物质基础. 但目前尚缺乏能稳定、高效表达上述标志物的体外细胞模型, 从而严重限制了以"治愈"为目标的药物筛选及机制探索. 本研究拟采用慢病毒转染技术, 以HepG2细胞为载体, 构建并筛选出能稳定、高效表达cccDNA、HBx等生物标志物的优势单克隆株, 以期为以cccDNA为靶点的新型HBV"治愈"药物研发, 以HBx为功能蛋白的肝纤维化启动机制、肝细胞癌发病机制、HBx-免疫系统跨细胞竞争机制等探索提供新的研究工具.

实验动机

本研究的主题是筛选出HBV1.3倍(1.3-fold HBV)基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株, 并鉴定出该优势单克隆株的HBV基因组整合入HepG2靶细胞的基因组位置, 及其在表达HBeAg、HBeAg、HBVDNA、cccDNA、HBx等标志物上的稳定性与活性.

实验目标

本研究的主要目标是筛选并鉴定出能稳定、高效表达cccDNA、HBx等标志物的1.3-fold HBV全基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株, 为"治愈"乙肝药物的研制及HBV相关疾病发病机制的探索奠定基础.

实验方法

本研究以最佳MOI值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2, 以抗生素BSD最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-fold HBV基因的HepG2细胞系, 1.3-fold HBV基因组扩增产物使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, Sanger测序鉴定各候选阳性单克隆细胞的侧翼序列对应的基因组插入位置, ELISA法检测HBsAg、HBeAg含量, PCR法检测HBVDNA、cccDNA、HBx表达水平.

实验结果

本研究成功筛选出1株能稳定、高效地表达HBsAg、HBeAg、HBVDNA、HBx、cccDNA标志物的优势单克隆株, 命名为HepGA14, 经鉴定其入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715.

实验结论

本研究构建并筛选出了1株能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株, 将在乙肝"治愈"药物的研制及肝硬化、肝癌、肝衰竭发病机制的研究上有较广阔的应用价值.

展望前景

本研究只观察了连续培养20代范围内HepGA14的表达规律, 对其长期传代(＞100代)后的表达稳定性及活性仍有待持续观察. 本项目组下一步, 将对于1.3倍HBV基因组插入HepG2后对宿主本身的细胞形态、功能及活性的影响; 对HepGA14转录出的产物是否具有与体内感染相一致的再感染性及致病功能; 对干扰素、核苷(酸)类似物及中药等抗病毒药物的应答敏感性等进行深入研究, 从而为实现攻克HBV做出积极贡献.