基础研究
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世界华人消化杂志. 2021-08-28; 29(16): 934-944
Published online 2021-08-28. doi: 10.11569/wcjd.v29.i16.934
HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定
邱华, 林栋毅, 李锦源
邱华, 林栋毅, 李锦源, 广西医科大学附属肿瘤医院 广西壮族自治区南宁市 530021
邱华, 教授, 研究方向为HBV感染相关肝癌、肝硬化的基础与临床研究.
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. 81860889、No.81660827; 中国博士后科学基金面上项目, No. 2019M653312; 广西自然科学基金面上项目, No. 2020GXNSFAA297113; 第二批广西高层次骨干人才培养139计划(桂卫科教发[2018]22号); 广西科技厅重点研发项目, No. 2017AB45166.
作者贡献分布: 此课题由邱华设计; 研究过程由邱华、林栋毅及李锦源操作完成; 数据分析由邱华, 林栋毅完成; 本论文写作由邱华、林栋毅完成.
通讯作者: 邱华, 教授, 博士, 博士后, 530021, 广西省南宁市青秀区河堤路71号, 广西医科大学附属肿瘤医院. qiuhua8899@163.com
收稿日期: 2021-05-28
修回日期: 2021-06-16
接受日期: 2021-07-07
在线出版日期: 2021-08-28
Abstract
背景

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础. 随着临床抗HBV治疗进入"功能性治愈""完全治愈"新时代的趋势, 对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)转录机制, 乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)致病机理的细胞模型的需求日益迫切. HBV1.3倍(1.3-fold HBV)全基因组包含了全部HBV生物信息, 能依赖自身启动子启动转录过程, 支持cccDNA形成和完整病毒复制, 最接近于HBV体内感染状态下的生命周期. 慢病毒转染是一种以慢病毒为载体, 将外源分子如DNA, RNA等导入真核细胞的技术, 可形成稳定转染.

目的

采用慢病毒转染技术构建HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型, 筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株.

方法

构建含1.3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒; 以最佳感染复数(MOI)值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2, 以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin, BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-fold HBV基因的HepG2细胞系(1.3-fold HBV-HepG2), 继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列. 将1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆, 通过测序各单克隆细胞的侧翼序列, 以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置, 再根据各候选单克隆株表达HBsAg、HBeAg的水平, 筛选出最优势单克隆株. 将该优势单克隆株与HepG2.2.15细胞株分别持续培养20代, 比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBV DNA等标志物的水平及稳定性.

结果

(1)将慢病毒pLenti-BSD-1.3-fold HBV以MOI = 30的参数侵染HepG2细胞, 72 h后加入BSD抗生素(终浓度1 μg/mL)进行筛选, 连续培养15-20 d后, 获得1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞系, PCR鉴定出HBV DNA序列; (2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中, 编号A14的细胞株(命名为HepGA14)的HBsAg、HBeAg表达水平最高, 分别为24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL, 其插入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715, 确定为优势单克隆株; (3)与HepG2.2.15细胞株比较, HepGA14优势单克隆株1-20代能稳定、高表达HBsAg、HBeAg、HBx、HBV DNA、cccDNA, 差异均具有统计学意义(P<0.05).

结论

成功构建并筛选出1.3-fold HBV基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14, 这为后续开展HBV-宿主关系、发病机制及药物筛选等奠定良好的基础.

Keywords: 乙型肝炎病毒; 1.3倍基因组; 稳转; 细胞模型; 优势单克隆

核心提要: 成功构建并筛选出乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14, 其能稳定、高效地表达共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)、HBVDNA、HBsAg、HBeAg等生物标志物, 有望在研制乙肝"治愈"药物及探索HBV相关疾病发病机制等领域发挥积极作用.