幽门螺杆菌耐药性及三种耐药检测方法的比较

文章亮点

实验背景

在我国, 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)的平均感染率高达50%以上. H. pylori能够引起胃黏膜炎症反应, 促进溃疡的形成. 根除H. pylori能够促进消化性溃疡愈合, 使约80%的早期胃MALT淋巴瘤获得缓解, 同时能预防胃癌发生. 当前国内的治疗方式主要是经验性治疗, H. pylori对不同抗菌药物的耐药率具有地域差异, 检测当地H. pylori菌株的抗生素的耐药情况, 对于指导本地区H. pylori的根除方案, 具有重要的临床价值.

实验动机

分析浙江地区H. pylori对常用抗生素的耐药率, 包括阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑, 对于本地区治疗中选择敏感的抗生素和最佳根除方案提供指导, 有助于提高治疗H. pylori的根除率. 同时, 研究荧光定量PCR法与药敏法和测序法在检测H. pylori耐药性中的一致性和灵敏度, 分析荧光定量PCR法检测H. pylori耐药性的优点及可行性, 推行个体化治疗用药, 有助于提高H. pylori的首次根除率, 减少抗生素使用时间和花费, 防止长期服用抗生素引起肠道微生物失衡.

实验目标

本实验旨在研究浙江地区H. pylori对常用抗生素的耐药现状, 发现当今经验性治疗下H. pylori对抗生素耐药率较高的情况, 揭示基于耐药检测的H. pylori根除治疗具有必要性. 同时探讨荧光定量PCR法在检测H. pylori耐药性中可行性, 未来应在现有荧光定量PCR检测体系上做出改进和优化, 依靠与其他分子生物学方法相结合、探针和引物筛选、反应条件优化, 提高对H. pylori耐药检测的灵敏度和准确性, 才能更好地在临床推广和使用.

实验方法

在国内研究中, 同时使用三种方法检测H. pylori耐药性尚且不多, 本实验通过培养法、荧光定量PCR法及测序法检测H. pylori耐药性并利用一致性统计研究方法比较三种耐药检测方法的一致性. 本研究选择2017-06/2017-09进行胃镜检查的305例患者, 取胃黏膜组织进行H. pylori菌株分离鉴定, 对分离的127个菌株进行6种抗生素的药敏实验, 提取菌株的DNA, 以荧光定量PCR法和测序法对克拉霉素耐药相关基因23S rRNA和左氧氟沙星耐药相关基因gyrA进行扩增和测序.

实验结果

本实验分离的浙江地区H. pylori菌株中尚无阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮耐药菌株; 克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑耐药率分别为33.86%、44.88%、91.34%、三重耐药率为18.90%; 克拉霉素和左氧氟沙星相关的主要耐药基因及其突变位点分别为23S rRNA(A2143G)、gyrA(C261A/G). 针对铋剂四联法中抗生素在国内应用的情况进行分析, 阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星是H. pylori根除治疗中使用最多的药物, 且H. pylori对克拉霉素、左氧氟沙星的耐药性较高, 因此临床在使用这些药物前, 需要根据H. pylori耐药情况. H. pylori耐药性检测方法包括药敏培养法、测序法和荧光定量PCR法. 不同耐药检测方法的一致性比较: 荧光定量PCR法与测序法检测耐药突变一致性较高, 灵敏度均大于90%, 与药敏培养法一致性相对较差, 灵敏度分别为69.8%(克拉霉素)和68.4%(左氧氟沙星).

实验结论

本研究未发现对阿莫西林、盐酸四环素、呋喃唑酮抗生素耐药的菌株. 除甲硝唑基本与其他研究者的报道相符, 克拉霉素、左氧氟沙星耐药率均较高, 在临床应用这些抗生素需结合耐药性, 选择敏感的抗生素个体化地用药, 提高根除效率. 三种耐药检测方法: 荧光定量PCR法与传统的药敏培养法检测耐药相比灵敏度为70%, 荧光定量PCR法与测序法相比较具有很高的一致性和灵敏度, 但荧光定量PCR法比测序法操作更加省时、直观、分析结果方便, 更适宜在临床推广和使用.

展望前景

荧光定量PCR体系包括: 引物、探针、模板DNA、底物、高品质的扩增酶及合适的反应条件, 本次实验中使用的荧光定量PCR试剂盒相比国外某品牌试剂盒在灵敏度和一致性方面尚有差距, 尚需要进行优化, 筛选更好的探针和引物序列, 优化反应条件, 提高反应试剂的灵敏度的和特异性, 增强荧光定量PCR检测H. pylori菌株耐药突变的能力.