circ_0001785与miR-330-5p在结直肠癌中的表达及其生物学意义

摘要

背景

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)发病机制尚未阐明, 环状RNA (circular RNA, circRNA)在CRC等肿瘤中表达异常并可调控细胞增殖、迁移及侵袭等生物学过程, 但关于其具体作用机制尚未完全阐明, 因而探寻新型circRNA分子并探究其可能作用机制对进一步揭示CRC发病机制具有重要意义.

目的

探讨circ_0001785与miR-330-5p在CRC中的表达及其生物学意义.

方法

采用qRT-PCR法检测CRC组织、癌旁组织中circ_0001785、miR-330-5p的表达量; 采用Pearson法检测CRC中circ_0001785与miR-330-5p的相关性; 根据circ_0001785、miR-330-5p表达量的平均值将患者分为circ_0001785高表达组41例、circ_0001785低表达组39例与miR-330-5p高表达组45例、miR-330-5p低表达组35例, 观察circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性; 体外培养人CRC细胞SW480, 分别将si-NC、si-circ_0001785、si-circ_0001785与anti-miR-NC、si-circ_0001785与anti-miR-330-5p转染至SW480细胞; 采用qRT-PCR法检测细胞中circ_0001785、miR-330-5p的表达量; 采用CCK-8法检测细胞增殖; Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭; 双荧光素酶报告实验检测circ_0001785与miR-330-5p的靶向关系; Western blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达量.

结果

circ_0001785在CRC组织及细胞系中表达水平显著升高(P<0.05), miR-330-5p的表达水平显著降低(P<0.05); circ_0001785与miR-330-5p呈负相关(r = -0.985, P<0.0001); circ_0001785、miR-330-5p表达量与分化程度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关(P<0.05); 与si-NC组比较, si-circ_0001785组细胞活力及MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05), 迁移及侵袭细胞数显著减少(P<0.05); 双荧光素酶报告实验证实circ_0001785可靶向结合miR-330-5p; 下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用.

结论

circ_0001785在CRC中表达上调, 而miR-330-5p表达下调, 干扰circ_0001785表达可通过上调miR-330-5p的表达从而抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭.

关键词: circ_0001785; miR-330-5p; 结直肠癌; 增殖; 迁移; 侵袭

核心提要: circ_0001785在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)中呈高表达, 干扰circ_0001785表达可通过靶向调控miR-330-5p而调控CRC细胞增殖、迁移及侵袭.

Biological significance of expression of circ_0001785 and miR-330-5p in colorectal cancer

Wei-Hua Zhao, Rui Ma, Xue-Hong Wen, Na Liu, Jian-Gong Hu, Xin-Feng Wang, Liang Ma

Wei-Hua Zhao, Xue-Hong Wen, Na Liu, Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300250, China

Rui Ma, Precision Medicine Laboratory, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Jian-Gong Hu, Xin-Feng Wang, Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Chinese Medicine, Tianjin 300250, China

Liang Ma, Clinical Laboratory, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

Corresponding author: Liang Ma, PhD, Associate Researcher, Laboratory, China-japan Friendship Hospital, No. 2 East Sakura Street, Chaoyang District, Beijing 100029, China. wumeijiu19700718@163.com

Received: June 28, 2020
Revised: August 5, 2020
Accepted: August 14, 2020
Published online: September 8, 2020

Abstract

BACKGROUND

The pathogenesis of colorectal cancer (CRC) has not been elucidated. Circular RNAs (circRNAs) are abnormally expressed in CRC and other tumors and can regulate the biological processes of cell proliferation, migration, and invasion. However, the specific mechanisms of action have not been fully elucidated. Therefore, exploration of new circRNA molecules and their possible mechanisms of action is of great significance to further reveal the pathogenesis of CRC.

AIM

To investigate the biological significance of expression of circ_0001785 and miR-330-5p in CRC.

METHODS

The expression levels of circ_0001785 and miR-330-5p in CRC tissues and adjacent tissues were detected by qRT-PCR. Pearson method was used to detect the correlation between circ_0001785 and miR-330-5p expression in CRC. According to the average values of circ_0001785 and miR-330-5p expression, patients were divided into 41 cases with high circ_0001785 expression, 39 with low circ_0001785 expression, 45 with high miR-330-5p expression, and 35 with low miR-330-5p expression. The correlation of the expression levels of circ_0001785 and miR-330-5p with the clinicopathological parameters of patients with CRC was observed. Human CRC cells SW480 were cultured in vitro, and si-NC, si-circ_0001785, si-circ_0001785 and anti-miR-NC, and si-circ_0001785 and anti-miR-330-5p were transfected into SW480 cells, respectively. The expression of circ_0001785 and miR-330-5p in transfected cells was detected by qRT-PCR. CCK-8 method was used to detect cell proliferation. Transwell assay was used to detect cell migration and invasion. The dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between circ_0001785 and miR-330-5p. Western blot was used to detect the protein expression of MMP-2 and MMP-9.

RESULTS

The expression level of circ_0001785 in CRC tissues and cell lines was significantly increased (P < 0.05), and the expression level of miR-330-5p was significantly decreased (P < 0.05). circ_0001785 expression was negatively correlated with miR-330-5p expression (r = -0.985, P < 0.0001). The expression levels of circ_0001785 and miR-330-5p were closely related to the degree of differentiation, lymph node metastasis, and TNM stage (P < 0.05). Compared with the si-NC group, the cell viability and the protein levels of MMP-2 and MMP-9 in the si-circ_0001785 group were significantly reduced (P < 0.05), and the number of migrating and invading cells was significantly reduced (P < 0.05). The dual luciferase reporter assay confirmed that circ_0001785 could target and bind to miR-330-5p. Down-regulation of miR-330-5p expression reduced the effect of interference with circ_0001785 expression on the proliferation, migration, and invasion of SW480 cells.

CONCLUSION

The expression of circ_0001785 is up-regulated in CRC, while the expression of miR-330-5p is down-regulated. Interfering with the expression of circ_0001785 inhibits the proliferation, migration, and invasion of CRC cells by up-regulating the expression of miR-330-5p.

Key Words: circ_0001785; miR-330-5p; Colorectal cancer; Proliferation; Migration; Invasion

0 引言

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是临床常见的消化系统恶性肿瘤之一, 其具有高病发率与死亡率, 由于肿瘤具有极强的转移能力导致患者预后不良, 随着CRC诊断及治疗技术的不断改善, 治疗效果提高但患者术后复发率仍未改善, 肿瘤相关基因可用于CRC靶向药物治疗, 因而寻找CRC治疗靶点成为研究重点[1-3]. 环状RNA(circular RNA, circRNA)在CRC发生及发展过程中发挥重要调控作用, 并可能作为CRC靶向治疗的潜在靶点[4]. circ_0001785在乳腺癌中表达水平升高, 沉默circ_0001785表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭[5]. 生物信息学分析显示miR-330-5p可能是circ_0001785的靶基因, miR-330-5p在CRC中的表达水平明显降低, 并可能参与CRC发生及发展过程[6]. 但circ_0001785是否可通过调控miR-330-5p的表达从而发挥作用尚未可知. 因此, 本研究主要探讨circ_0001785在CRC中的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭的影响, 探究其对miR-330-5p的靶向调控作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料: 选取2016-05/2019-05本院收治的80例CRC患者为研究对象, 所有患者均经病理证实为CRC, 术前均未进行放疗或化疗, 其中男50例, 女30例, 年龄45-70岁, 平均年龄66.52岁±6.98岁, 收集患者临床病理资料, 主要包括肿瘤(tumor node metastasis, TNM)分期、分化程度、淋巴结转移等, 所有患者均于术中切除CRC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘5 cm处), 放入液氮中, 置于-80℃超低温冰箱保存. 根据circ_0001785、miR-330-5p表达量的平均值将患者分为circ_0001785高表达组41例、circ_0001785低表达组39例与miR-330-5p高表达组45例、miR-330-5p低表达组35例, 观察circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性.

1.1.2 主要试剂: 正常结肠上皮细胞NCM460、人CRC细胞SW480购自美国ATCC细胞库; DMEM培养基购自美国Gibco公司; 胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司; Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司; 反转录与荧光定量检测试剂盒购自日本TaKaRa公司; si-NC、si-circ_0001785、miR-NC、miR-330-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-330-5p购自上海吉玛制药技术有限公司; pcDNA3.1购自上海联迈生物工程有限公司; Transwell小室购自美国Corning公司; Matrigel基质胶购自美国BD公司; CCK-8检测试剂盒购自上海泽叶生物有限公司; 兔抗人MMP-2、MMP-9抗体购自美国CST公司; HRP标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 实验分组: NCM460细胞与SW480细胞常规培养, 待细胞生长融合度达到80%时进行传代培养. 取对数生长期SW480细胞接种于96孔板(1×10⁴个/孔), 参照Lipofectamine2000试剂盒分别将si-NC、si-circ_0001785、si-circ_0001785与anti-miR-NC、si-circ_0001785与anti-miR-330-5p转染至SW480细胞, 分别记作si-NC组、si-circ_0001785组、si-circ_0001785+anti-miR-NC组、si-circ_0001785+anti-miR-330-5p组.

1.2.2 qRT-PCR检测circ_0001785、miR-330-5p的表达水平: 采用Trizol法提取CRC组织、癌旁组织、NCM460细胞、SW480细胞及转染后各组SW480细胞中总RNA, 应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度. 反转录合成cDNA. circ_0001785正向引物5'-CAGTTTTTGATTGCCCCTCC-3', 反向引物5'-GTGTCGTGGGTCTAGTAACC-3'; miR-330-5p正向引物5'-AGAATCGCTTGAAC CCAGGA-3', 反向引物5'-AACAGGGAGAAGTGAGAGGC-3'; U6正向引物5'-GCTTCGG CAGCACATATACT-3', 反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'; GAPDH正向引物5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3', 反向引物5'-GGAAGATGGTGA TGGGATT-3', 引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成. PCR扩增反应体系: SYBR Green Master Mix 10 μL, 正反向引物0.8 μL, cDNA 2 μL, ddH₂O补足体系至20 μL; 反应条件: 95℃ 2 min, 95℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40次循环. circ_0001785以GAPDH为内参, miR-330-5p以U6为内参, 采用2-^△△Ct法计算circ_0001785、miR-330-5p相对表达量.

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖: 取各组SW480细胞接种于96孔板(5×10³个/孔), 置于培养箱培养24 h, 每孔分别加入10 μL CCK-8溶液, 继续培养2 h, 应用酶标仪检测各孔在波长450 nm处的OD值.

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭: 细胞迁移实验: 将SW480细胞接种于Transwell小室的上室(3×10⁴个/孔), Transwell小室的下室中加入600 μL含有10%胎牛血清的培养液, 置于培养箱继续培养24 h, 取出小室, PBS洗涤, 分别采用多聚甲醛固定与0.1%结晶紫染液染色, 置于显微镜下观察迁移细胞数. 细胞侵袭实验: Matrigel基质胶稀释液接种于Transwell小室的上室(40 μL/孔), 置于培养箱孵育5 h, 后续实验步骤同细胞迁移实验, 置于显微镜下观察侵袭细胞数.

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测circ_0001785与miR-330-5p的靶向关系: circinteractome预测显示circ_0001785与miR-330-5p存在结合位点, 分别构建野生型载体WT-circ_0001785与突变型载体MUT-circ_0001785, 将WT-circ_0001785、MUT-circ_0001785与miR-NC、miR-330-5p mimics共转染至SW480细胞, 转染24 h后收集细胞, 检测细胞相对荧光素酶活性.

1.2.6 Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达: 收集各组SW480细胞, 加入500 μL RIPA裂解液提取细胞蛋白, BCA法测定蛋白浓度, 蛋白变性, SDS-PAGE分离蛋白, 转移至PVDF膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入一抗稀释液(1:1000), 4℃孵育过夜, TBST洗涤, 分别加入二抗稀释液(1:2000), 室温孵育1 h, TBST洗涤, 曝光, 显影, 应用ImageJ软件分析各条带灰度值.

统计学处理 采用SPSS 21.0统计学软件分析数据, 计量资料以mean±SD表示且均符合正态分布, 两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析; 计数资料用n (%)表示, 采用χ²检验; 采用Pearson法检测CRC中circ_0001785与miR-330-5p的相关性, 以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 CRC中circ_0001785与miR-330-5p的表达量及其相关性分析

与癌旁组织比较, CRC组织中circ_0001785的表达水平显著升高(P<0.05), miR-330-5p的表达水平显著降低(P<0.05), 见表1. 采用Pearson法检测CRC中circ_0001785与miR-330-5p的相关性, 结果显示circ_0001785与miR-330-5p呈负相关(r = -0.985, P<0.0001), 见图1.

表1 结直肠癌中circ_0001785与miR-330-5p的表达量(mean±SD, n = 80).

组别	circ_0001785	miR-330-5p
癌旁组织	1.00±0.22	0.99±0.20
结直肠癌组织	2.07±0.42a	0.58±0.16a
t	20.185	14.318
P值	0.000	0.000

^aP<0.05, 与癌旁组织比较.

图1 circ_0001785与miR-330-5p的相关性分析.

2.2 circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性分析

根据circ_0001785、miR-330-5p表达量的平均值将患者分为circ_0001785高表达组41例、circ_0001785低表达组39例与miR-330-5p高表达组45例、miR-330-5p低表达组35例, 比较分析circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性, 结果显示circ_0001785、miR-330-5p表达量与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05), 见表2.

表2 circ_0001785、miR-330-5p表达量与结直肠癌患者临床病理参数的相关性分析(n).

临床病理参数	n	circ_0001785		χ2, P值	miR-330-5p		χ2, P值
		高表达组(n = 41)	低表达组(n = 39)		高表达组(n = 45)	低表达组(n = 35)
年龄				0.093, 0.761			0.684, 0.408
<55岁	28	15	13		14	14
≥55岁	52	26	26		31	21
分化程度				35.361, 0.000			38.553, 0.000
高/中分化	47	11	36		40	7
低分化	33	30	3		5	28
淋巴结转移				37.115, 0.000			61.068, 0.000
无	44	9	35		42	2
有	36	32	4		3	33
TNM分期				31.894, 0.000			45.025, 0.000
Ⅰ-Ⅱ期	51	14	37		43	8
Ⅲ-Ⅳ期	29	27	2		2	27

TNM分期: 肿瘤分期.

2.3 CRC细胞与正常结肠上皮细胞中circ_0001785、miR-330-5p的表达量比较

与NCM460比较, SW480细胞中circ_0001785的表达水平显著升高(P<0.05), miR-330-5p的表达水平显著降低(P<0.05), 见表3.

表3 结直肠癌细胞与正常结肠上皮细胞中circ_0001785、miR-330-5p的表达量比较(mean±SD, n = 9).

组别	circ_0001785	miR-330-5p
NCM460	1.02±0.02	1.01±0.04
SW480	2.53±0.20a	0.53±0.15a
t	22.538	9.276
P值	0.000	0.000

^aP<0.05, 与NCM460比较.

2.4 干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的影响

与si-NC组比较, si-circ_0001785组细胞活力显著降低(P<0.05), 迁移及侵袭细胞数显著减少(P<0.05), MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05), 见图2、表4.

图2 干扰circ_0001785表达对结直肠癌细胞SW480迁移及侵袭的影响. A: 迁移及侵袭图; B: Western blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达.

表4 干扰circ_0001785表达对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的影响(mean±SD, n = 9).

组别	circ_0001785	OD值	迁移细胞数	侵袭细胞数	MMP-2	MMP-9
si-NC	0.99±0.01	0.69±0.04	98.67±3.24	108.56±8.83	0.86±0.08	0.88±0.06
si-circ_0001785	0.28±0.05a	0.40±0.04a	63.22±5.85a	76.78±6.74a	0.50±0.08a	0.57±0.11a
t	41.773	15.380	15.903	8.583	9.546	7.422
P值	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与si-NC组比较.

2.5 circ_0001785靶向调控miR-330-5p

circinteractome预测显示circ_0001785与miR-330-5p存在结合位点, 见图3. 双荧光素酶报告实验结果显示, miR-330-5p过表达可降低野生型载体WT-circ_0001785荧光素酶活性(P<0.05), 而对突变型载体MUT-circ_0001785荧光素酶活性无明显影响(P>0.05), 见表5. 与si-NC组比较, si-circ_0001785组miR-330-5p的表达水平显著升高(P<0.05); 与pcDNA组比较, pcDNA-circ_0001785组miR-330-5p的表达水平显著降低(P<0.05), 见表6.

图3 circ_0001785的序列中含有与miR-330-5p互补的核苷酸序列.

表5 双荧光素酶报告实验(mean±SD, n = 9).

组别	WT-circ_0001785	MUT-circ_0001785
miR-NC	1.02±0.03	1.02±0.01
miR-330-5p	0.63±0.06a	1.02±0.02
t	17.441	0.000
P值	0.000	1.000

^aP<0.05, 与miR-NC组比较.

表6 circ_0001785靶向调控miR-330-5p的表达(mean±SD, n = 9).

组别	miR-330-5p
si-NC	1.00±0.01
si-circ_0001785	2.67±0.28a
pcDNA	0.99±0.01
pcDNA-circ_0001785	0.24±0.07c
F	454.721
P值	0.000

^aP<0.05, 与si-NC组比较;

^cP<0.05, 与pcDNA组比较.

2.6 下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用

与si-circ_0001785+anti-miR-NC组比较, si-circ_0001785+anti-miR-330-5p组细胞活力显著升高(P<0.05), 迁移及侵袭细胞数显著增多(P<0.05), MMP-2、MMP-9蛋白水平显著升高(P<0.05), 见图4、表7.

图4 Western blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达量.

表7 下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用(mean±SD, n = 9).

组别	miR-330-5p	OD值	迁移细胞数	侵袭细胞数	MMP-2	MMP-9
si-circ_0001785+anti-miR-NC	1.00±0.01	0.40±0.06	63.33±5.57	76.22±7.84	0.50±0.12	0.57±0.04
si-circ_0001785+anti-miR-330-5p	0.27±0.09a	0.63±0.07a	82.22±7.64a	103.56±4.48a	0.78±0.06a	0.73±0.05a
t	24.185	7.484	5.994	9.083	6.261	7.496
P值	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与si-circ_0001785+anti-miR-NC组比较.

3 讨论

CRC发病率逐年升高, 患者生存率未明显改善, 其发病机制较为复杂, 研究表明circRNA可充当miRNA的海绵分子从而参与CRC发生及发展过程[7-9]. circRNA还可能作为CRC诊断及治疗的潜在靶点[10,11]. 但circRNA在CRC发生及转移过程中的作用机制尚未完全阐明.

circ_0001785在骨肉瘤中表达水平升高, 并可充当miR-1200的海绵分子从而促进骨肉瘤发生及发展[12]. circ_0001785在乳腺癌中表达水平升高, 并可能作为诊断乳腺癌的生物标志物[13]. 本研究结果显示CRC组织中circ_0001785的表达水平升高, 根据circ_0001785表达量的平均值将患者分为高表达组与低表达组, 观察其与患者临床病理参数的相关性, 结果显示随着circ_0001785的表达水平升高, 患者分化程度降低、淋巴结转移及TNM分期升高, 提示circ_0001785在CRC发生及发展过程中可能发挥癌基因作用. 同时本研究通过体外细胞实验证实干扰circ_0001785表达可降低细胞活力, 减少迁移及侵袭细胞数, 提示干扰circ_0001785表达可减弱CRC细胞增殖、迁移及侵袭能力. 研究表明MMP-2、MMP-9表达水平升高可通过降解细胞外基质沉积从而促进细胞迁移及侵袭[14]. 本研究结果显示干扰circ_0001785表达可降低CRC细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平, 进一步证实干扰circ_0001785表达可抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭.

本研究Pearson法分析显示circ_0001785与miR-330-5p呈负相关. 研究表明敲除circ-FARSA可通过调节miR-330-5p/LASP1分子轴而抑制CRC细胞的生长[15]. circPTN海绵可调控miR-145-5p/miR-330-5p表达从而促进神经胶质瘤细胞增殖[16]. miR-330-5p靶向SPRY2参与肝癌的进展进程[17]. 沉默LncRNA LEF1-AS1通过充当miR-330-5p的海绵分子从而抑制前列腺癌的发生及发展[18]. miR-330-5p通过靶向ITGA5抑制胶质母细胞瘤细胞增殖及侵袭[19]. 本研究结果显示CRC组织中miR-330-5p的表达水平降低, 与上述研究结果相似, 进一步分析显示miR-330-5p表达量与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关, 提示miR-330-5p在CRC发生及发展过程中发挥重要调控作用. 本研究通过双荧光素酶实验与qRT-PCR实验证实circ_0001785可靶向结合miR-330-5p, 并可负向调控miR-330-5p的表达. 同时本研究将anti-miR-330-5p与si-circ_0001785共转染至CRC细胞, 结果显示细胞活力升高, 迁移及侵袭细胞数增多, MMP-2、MMP-9的表达水平升高, 提示下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用.

4 结论

综上所述, 干扰circ_0001785表达可通过上调miR-330-5p的表达从而抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭, 并可能作用CRC治疗的潜在靶点. 但关于其具体作用机制仍需进一步探讨, 下一步将进行体内动物实验及检测相关信号通路以期进一步证实circ_0001785与miR-330-5p在CRC发生及发展过程中的作用机制.

文章亮点

实验背景

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)发病率逐年上升, 由于其临床症状不明显导致大部分患者确诊时已处于中晚期, 随着医疗技术的发展, 分子靶向治疗成为肿瘤的主要治疗手段, 目前CRC发病机制尚未阐明, 环状RNA (circular RNA, circRNA)在CRC等肿瘤中表达异常, 并可能作为CRC诊断及治疗的潜在靶标.

实验动机

circRNA在肿瘤发生及发展过程中可能发挥癌基因作用, 但其在CRC中的研究相对较少, 因而积极探寻新型cricRNA并分析其可能作用机制, 为阐释CRC发病机制及其治疗提供潜在靶标.

实验目标

干扰circ_0001785表达可通过上调miR-330-5p的表达从而抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭.

实验方法

采用qRT-PCR法检测CRC组织及细胞系中circ_0001785与miR-330-5p的表达量; 采用Pearson法分析CRC组织中circ_0001785与miR-330-5p表达量的相关性; 观察circ_0001785、miR-330-5p表达量与患者临床病例参数的相关性; 体外细胞实验验证circ_0001785、miR-330-5p对细胞增殖、迁移及侵袭的影响, 探究二者之间的靶向关系.

实验结果

circ_0001785在CRC组织及细胞系中呈高表达, 而miR-330-5p呈低表达, 二者呈负相关, 其表达量与分化程度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关; 体外细胞实验结果显示干扰circ_0001785表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭; circ_0001785可靶向结合miR-330-5p; circ_0001785可通过靶向调控miR-330-5p而发挥作用.

实验结论

干扰circ_0001785表达可负向调控miR-330-5p表达进而减弱CRC细胞增殖、迁移及侵袭能力.

展望前景

关于miR-330-5p如何调控下游靶基因表达及其可能作用机制仍需进一步探究.

备注

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 天津市

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科学编辑:张晗 制作编辑:刘继红

参考文献

1.	陈 晓燕, 罗 金键. CXCL8在结直肠癌组织中的表达及其临床意义. 新乡医学院学报. 2018;35:505-508.  [PubMed]  [DOI]

2.	王 金艳, 张 志勇, 张 学明, 甄 晓月, 李 雪梅, 冯 俊伟, 吴 晨鹏, 胡 月明. 结直肠癌中miR-301b的表达及其临床意义. 临床与实验病理学杂志. 2019;35:318-320.  [PubMed]  [DOI]

3.	蔡 锐文, 梁 伟成, 黄 冀华, 梁 华艳, 黄 开劲, 邓 波. MicroRNA-29a在结直肠癌组织中的表达及意义. 中国现代医学杂志. 2019;29:43-47.  [PubMed]  [DOI]

4.	Geng Y, Zheng X, Hu W, Wang Q, Xu Y, He W, Wu C, Zhu D, Wu C, Jiang J. Hsa_circ_0009361 acts as the sponge of miR-582 to suppress colorectal cancer progression by regulating APC2 expression. Clin Sci (Lond). 2019;133:1197-1213.  [PubMed]  [DOI]

5.	张 艳娜, 孙 江涛, 刘 孝民, 宋 开放, 王 亚格, 肖 中岳. 沉默环状RNA hsa_circ_0001785表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响. 现代肿瘤医学. 2019;27:26-31.  [PubMed]  [DOI]

6.	Yoo HI, Kim BK, Yoon SK. MicroRNA-330-5p negatively regulates ITGA5 expression in human colorectal cancer. Oncol Rep. 2016;36:3023-3029.  [PubMed]  [DOI]

7.	Zhang XL, Xu LL, Wang F. Hsa_circ_0020397 regulates colorectal cancer cell viability, apoptosis and invasion by promoting the expression of the miR-138 targets TERT and PD-L1. Cell Biol Int. 2017;41:1056-1064.  [PubMed]  [DOI]

8.	Shen T, Cheng X, Liu X, Xia C, Zhang H, Pan D, Zhang X, Li Y. Circ_0026344 restrains metastasis of human colorectal cancer cells via miR-183. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019;47:4038-4045.  [PubMed]  [DOI]

9.	Chen Z, Ren R, Wan D, Wang Y, Xue X, Jiang M, Shen J, Han Y, Liu F, Shi J, Kuang Y, Li W, Zhi Q. Hsa_circ_101555 functions as a competing endogenous RNA of miR-597-5p to promote colorectal cancer progression. Oncogene. 2019;38:6017-6034.  [PubMed]  [DOI]

10.	Yang G, Zhang T, Ye J, Yang J, Chen C, Cai S, Ma J. Circ-ITGA7 sponges miR-3187-3p to upregulate ASXL1, suppressing colorectal cancer proliferation. Cancer Manag Res. 2019;11:6499-6509.  [PubMed]  [DOI]

11.	Zhong D, Li P, Gong PY. Hsa_circ_0005075 promotes the proliferation and invasion of colorectal cancer cells. Int J Biol Markers. 2019;34:284-291.  [PubMed]  [DOI]

12.	Li S, Pei Y, Wang W, Liu F, Zheng K, Zhang X. Circular RNA 0001785 regulates the pathogenesis of osteosarcoma as a ceRNA by sponging miR-1200 to upregulate HOXB2. Cell Cycle. 2019;18:1281-1291.  [PubMed]  [DOI]

13.

Lehto M, Tuomi T, Mahtani MM, Widén E, Forsblom C, Sarelin L, Gullström M, Isomaa B, Lehtovirta M, Hyrkkö A, Kanninen T, Orho M, Manley S, Turner RC, Brettin T, Kirby A, Thomas J, Duyk G, Lander E, Taskinen MR, Groop L. Characterization of the MODY3 phenotype. Early-onset diabetes caused by an insulin secretion defect. J Clin Invest. 1997;99:582-591.  [PubMed]  [DOI]

14.

Inoue M, Uchida Y, Edagawa M, Hirata M, Mitamura J, Miyamoto D, Taketani K, Sekine S, Kawauchi J, Kitajima S. The stress response gene ATF3 is a direct target of the Wnt/β-catenin pathway and inhibits the invasion and migration of HCT116 human colorectal cancer cells. PLoS One. 2018;13:e0194160.  [PubMed]  [DOI]

15.	Lu C, Fu L, Qian X, Dou L, Cang S. Knockdown of circular RNA circ-FARSA restricts colorectal cancer cell growth through regulation of miR-330-5p/LASP1 axis. Arch Biochem Biophys. 2020;689:108434.  [PubMed]  [DOI]

16.	Chen J, Chen T, Zhu Y, Li Y, Zhang Y, Wang Y, Li X, Xie X, Wang J, Huang M, Sun X, Ke Y. circPTN sponges miR-145-5p/miR-330-5p to promote proliferation and stemness in glioma. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38:398.  [PubMed]  [DOI]

17.	Xiao S, Yang M, Yang H, Chang R, Fang F, Yang L. miR-330-5p targets SPRY2 to promote hepatocellular carcinoma progression via MAPK/ERK signaling. Oncogenesis. 2018;7:90.  [PubMed]  [DOI]

18.	Liu DC, Song LL, Liang Q, Hao L, Zhang ZG, Han CH. Long noncoding RNA LEF1-AS1 silencing suppresses the initiation and development of prostate cancer by acting as a molecular sponge of miR-330-5p via LEF1 repression. J Cell Physiol. 2019;234:12727-12744.  [PubMed]  [DOI]

19.	Feng L, Ma J, Ji H, Liu Y, Hu W. miR-330-5p suppresses glioblastoma cell proliferation and invasiveness through targeting ITGA5. Biosci Rep. 2017;37:BSR20170019.  [PubMed]  [DOI]