基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2017. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2017-07-08; 25(19): 1743-1749
在线出版日期: 2017-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v25.i19.1743
聚乙二醇干扰素α-2a对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞表面IFNGR1的影响
程笑, 汪莉萍, 韩方正, 庞亚博, 黄姜伟
程笑, 汪莉萍, 韩方正, 庞亚博, 黄姜伟, 徐州医科大学附属医院感染科 江苏省徐州市 221002
程笑, 住院医师, 主要从事感染疾病的研究.
作者贡献分布: 此课题设计、研究所用新试剂及分析工具由汪莉萍与韩方正完成与提供; 研究过程与数据分析由程笑、庞亚博及黄姜伟操作完成; 本论文写作由程笑与汪莉萍完成.
通讯作者: 汪莉萍, 主任医师, 221002, 江苏省徐州市泉山区淮海西路99号, 徐州医科大学附属医院感染科. 306972254@qq.com
电话: 0516-83353578
收稿日期: 2017-04-16
修回日期: 2017-05-15
接受日期: 2017-05-19
在线出版日期: 2017-07-08

目的

研究聚乙二醇干扰素α-2a(polyethylene glycol interferon α-2a, PEG-IFNα-2a)对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者外周血中干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)及γ干扰素受体1(interferon gamma receptor 1, IFNGR1)水平的影响.

方法

应用PEG-IFNα-2a治疗的不同时间点抽取CHB患者及健康对照组静脉血, 酶联免疫吸附法检测其血清IFN-γ浓度, 实时荧光定量RT-PCR技术检测其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuelear cells, PBMCs)表面IFNGR1的表达情况.

结果

CHB组患者IFN-γ及IFNGR1均高于健康对照组(P<0.05). 在使用聚乙二醇干扰素抗病毒治疗过程中, CHB患者IFN-γ及IFNGR1在12 wk时达到高峰, 此后开始下降, 至48 wk时低于治疗前水平, 但仍高于健康对照组(P<0.05). 抗病毒治疗12 wk时, 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)DNA阴转组IFNGR1的表达水平高于HBV DNA未阴转组(2.22±0.65 vs 1.35±0.71), 两者差异有统计学意义(P<0.05).

结论

IFN-γ参与了CHB的发病, 治疗12 wk时患者PBMCs表面IFNGR1的表达水平可能作为干扰素抗HBV治疗早期预测干扰素疗效的因子.

关键词: 慢性乙型肝炎; 乙型肝炎病毒; 干扰素-γ; 干扰素受体1

核心提要: 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的发病机制尚未完全明确. 目前认为, 乙型肝炎病毒感染慢性化与机体免疫调控紊乱特别是细胞免疫反应密切相关. 干扰素-γ作为重要的细胞因子, 其生物学作用的发挥依赖与其受体γ干扰素受体1(interferon gamma receptor 1, IFNGR1)的结合. 本文研究了聚乙二醇干扰素α-2a对CHB患者外周血单个核细胞表面IFNGR1的影响, 为临床了解CHB患者病情发展程度及指导干扰素等药物的临床应用提供依据.
引文著录: 程笑, 汪莉萍, 韩方正, 庞亚博, 黄姜伟. 聚乙二醇干扰素α-2a对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞表面IFNGR1的影响. 世界华人消化杂志 2017; 25(19): 1743-1749
Effect of treatment with pegylated interferon α-2a on expression of IFNGR1 on peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B
Xiao Cheng, Li-Ping Wang, Fang-Zheng Han, Ya-Bo Pang, Jiang-Wei Huang
Xiao Cheng, Li-Ping Wang, Fang-Zheng Han, Ya-Bo Pang, Jiang-Wei Huang, Department of Infectious Diseases, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
Correspondence to: Li-Ping Wang, Chief Physician, Department of Infectious Diseases, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, 99 Huaihai West Road, Quanshan District, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China. 306972254@qq.com
Received: April 16, 2017
Revised: May 15, 2017
Accepted: May 19, 2017
Published online: July 8, 2017

AIM

To detect serum levels of interferon-γ (IFN-γ) and expression of gamma receptor 1 (IFNGR1) on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with chronic hepatitis B (CHB) after treatment with polyethylene glycol interferon α-2a (PEG-IFNα-2a).

METHODS

Serum levels of IFN-γ were determined using ELISA in patients with chronic hepatitis B and healthy controls, and the expression of IFNGR1 on PBMCs was determined using real-time fluorescent quantitative RT-PCR.

RESULTS

Serum levels of IFN-γ and exprssion ofIFNGR1 on PBMCs in patients with chronic hepatitis B were higher than those in healthy controls (P < 0.05). IFN-γ and exprssion ofIFNGR1 on PBMCs in patients with chronic hepatitis B peaked at 12 wk after treatment with PEG-IFNα-2a, and then began to decrease, which was lower than pre-treatment at 48 wk, but still higher than that of healthy controls (P < 0.05). The expression of IFNGR1 on PBMCs in the hepatitis B virus (HBV) DNA negative group was higher than that in the HBV DNA positive group (2.22 ± 0.65 vs 1.35 ± 0.71, P < 0.05) at 12 wk after treatment with PEG-IFNα-2a.

CONCLUSION

IFN-γ may participate in the pathogenesis of chronic hepatitis B, and the expression of IFNGR1 on PBMCs in patients with chronic hepatitis B at 12 wk of treatment may be used as an early predictor of interferon efficacy.

Key Words: Chronic hepatitis B; Hepatitis B virus; Interferon-γ; Interferon receptor 1
0 引言

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是长期影响人类健康的一大难题, 全球约有2.4亿人为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者, 若不防治可进展为肝硬化、肝衰竭、肝癌等严重疾病[1,2]. 干扰素是公认的治疗CHB的有效药物[3]. 目前认为, HBV感染慢性化与机体免疫调控紊乱特别是细胞免疫反应密切相关. 干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)是人体感染HBV后细胞免疫的重要的效应分子[4], 大量研究[5-7]资料表明, 慢性HBV感染者IFN-γ表达和分泌水平异常. IFN-γ作为重要的细胞因子, 发挥生物学作用依赖与其受体相结合[8], γ-干扰素受体特别是γ干扰素受体1(interferon gamma receptor 1, IFNGR1)是γ-干扰素信号通路的门户, 他的表达及功能状态决定了IFN-γ的效应[9]. 本研究旨在探讨CHB的发病过程与IFN-γ及IFNGR1是否相关, 并观察应用聚乙二醇干扰素α-2a(polyethylene glycol interferon α-2a, PEG-IFNα-2a)治疗对IFN-γ及IFNGR1的变化规律, 为指导临床CHB的治疗提供依据.

1 材料和方法
1.1 材料

纳入2014-02/2016-06于徐州医科大学附属医院感染性疾病科住院和门诊就诊的尚未接受抗HBV治疗的CHB患者53例(男33例, 女20例, 平均年龄为32.37岁±12.68岁), 其诊断标准均符合2015年中华医学会肝脏病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[10]. 另选择同时期体检的10例健康人(男7例, 女3例, 平均年龄为21.50岁±7.16岁)作为对照. 2组研究对象在年龄、性别分布上均无统计学差异(P>0.05). 所有研究对象需排除甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒感染; 酒精性肝病、药物性肝损害、及自身免疫性肝病; 治疗期间服用过激素类药物等. Human IFN-r ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司, Thermo MK3型酶标仪购自美国BioTek公司, TRIzol试剂、反转录多聚酶链式反应试剂盒(M-MLV试剂盒)、SYBR Green qPCR SuperMix-UDG荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司. PEG-IFNα-2a(商品名: 派罗欣, 上海罗氏制药有限公司).

1.2 方法

1.2.1 治疗: 病例组所有患者应用PEG-IFNα-2a 135 μg(体质量≤65 kg)或180 μg(体质量>65 kg), 1次/wk皮下注射, 持续注射时间为48 wk.

1.2.2 IFN-γ的检测: 抽取病例组基线及治疗第4、12、24、48周时的空腹肘静脉血2 mL, 30 min内常规离心, 分离血清, 血清标本冻存于-80 ℃超低温冰箱待测. 采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清IFN-γ, 操作步骤严格按照试剂盒规定的进行. 试剂盒灵敏度为0.3 pg/mL, 每样本均设2个复孔, 显色后在全自动酶标仪上450 nm波长处测光密度值, 根据标准曲线将光密度值换算成浓度(pg/mL).

1.2.3 IFNGR1的检测: 抽取病例组基线及治疗4、12、24、48 wk时空腹抽取肘静脉血5 mL加入试管中进行肝素抗凝, 使用密度梯度离心

法进行单一细胞核分离. 将得到的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuelear cells, PBMCs)加入TRIzol试剂, 严格按照TRIzol使用说明书进行操作, 使用TRIzol→氯仿→异丙醇→乙醇的方法对RNA进行提取. 提取RNA后, 使用逆转录进行合成. 严格按照试剂盒使用说明书进行操作.

合成方法: 使用从PBMCs中提取的RNA, 加入oligo(dT18)引物及M-MLV反转成cDNA, 加入DEPC水重悬沉淀, 55 ℃-60 ℃水浴10-15 min后酶标仪检测RNA浓度和纯度. 反转录条件为70 ℃ 5 min, 42 ℃ 50 min, 95 ℃ 5 min. 参考既往文献设计引物[11], 应用Premier Primer5.0引物设计软件设计Human IFNGR1受体上游引物: 5'-TGGCTCTCCTCTTTCTCCTACC-3', 下游引物: 5'-ACATTAGTTGGTGTAGGCACTGA-3'; β-actin上游引物: 5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3', 下游引物: 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATC-CT-3'. 操作按PCR试剂盒说明进行. PCR热循环参数: 95 ℃ 4 min, 然后3步反应: 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40个循环, 在每个循环的最后一步收集荧光信号. 据软件所得Ct值进行统计学分析. 采用-△△Ct代表IFNGR1 mRNA转录量的相对水平[12], 计算IFNGR1 mRNA的相对表达值.

1.2.4 ALT检测: 采用美国Beckma全自动生化仪及其配套试剂检测, 检测标本为空腹静脉血血清.

1.2.5 HBV DNA检测: 采用采用实时荧光定量PCR仪及其配套试剂检测, 检测标本为空腹静脉血血清, 检测下限500 IU/mL.

统计学处理 运用SPSS19.0进行统计分析. 计量资料采用mean±SD表示, 采用t检验, 计数资料的比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 病例组和健康对照组血清IFN-γ及PBMCs表面IFNGR1比较

本研究显示病例组患者治疗前测定的血清IFN-γ浓度及PBMCs表面IFNGR1的表达水平均明显高于健康对照组, 差别有统计学意义(P< 0.05, 表1).

表1 病例组和健康对照组外周血IFN-γ及IFNGR1比较.
分组nIFN-γ(pg/mL)IFNGR1
病例组5354.10±23.800.65±0.26
健康对照组1030.21±14.070.41±0.13
t值9.1585.480
P值<0.05<0.05
IFN-γ: 干扰素-γ; IFNGR1: γ干扰素受体1.
2.2 PEG-IFNα-2a治疗过程中血清IFN-γ及PBMCs表面IFNGR1的变化

IFN-γ和IFNGR1在治疗后4 wk开始上升, 至第12周达到高峰, 此后开始下降, 至48 wk时低于治疗前水平, 但仍高于健康组, 差异有统计学意义(P<0.05). 治疗12 wk较治疗前比较差异有统计学意义, 其余各治疗点较治疗前均无统计学意义(表2).

表2 PEG-IFNα-2a治疗CHB患者外周血IFNγ及IFNGR1的变化.
分组IFN-γ(pg/mL)IFNGR1
健康对照组30.21±14.070.41±0.13
病例组
基线组54.10±23.800.65±0.26
4 wk61.46±26.081.15±0.62
12 wk78.49±22.79a1.81±0.32a
24 wk58.82±28.931.35±0.45
48 wk53.82±23.61c0.53±0.16c
aP<0.05 vs 基线组;
cP<0.05 vs 健康对照组. CHB: 慢性乙型肝炎; IFN-γ: 干扰素-γ; IFNGR1: γ干扰素受体1.
2.3 PEG-IFNα-2a治疗后发生HBV DNA阴转和未发生HBV DNA阴转患者的血清IFN-γ比较

抗病毒治疗前, 发生HBV DNA的患者抗病毒治疗前IFN-γ浓度低于未发生阴转的患者, 但两者差异无统计学意义. 随访4、12 wk时, 发生HBV DNA的患者抗病毒治疗前IFN-γ浓度均高于此时未发生阴转的患者IFN-γ浓度, 但两者差异无统计学意义. 随访24和48 wk时, 发生HBV DNA的患者抗病毒治疗前IFN-γ浓度均低于此时未发生阴转的患者IFN-γ浓度, 两者差异无统计学意义(表3).

表3 治疗后发生HBV DNA阴转的和未阴转的患者血清IFN-γ比较 (pg/mL).
分组HBV DNA阴转组(n = 29)HBV DNA未阴转组(n = 24)
基线组28.11±15.7132.44±12.46
4 wk62.67±29.8751.62±27.77
12 wk86.51±23.2373.87±21.33
24 wk44.54±23.2553.36±32.54
48 wk51.24±22.5956.32±24.67
HBV: 乙型肝炎病毒; IFN-γ: 干扰素-γ.
2.4 PEG-IFNα-2a治疗后发生HBV DNA阴转和未发生HBV DNA阴转患者的PBMCs表面IFNGR1比较

抗病毒治疗前, 发生HBV DNA的患者抗病毒治疗前IFNGR1表达水平高于未发生阴转的患者, 但两者差异无统计学意义. 随访4、24、48 wk时, 发生HBV DNA的患者抗病毒治疗前PBMCs表面IFNGR1表达水平均高于此时未发生阴转的患者, 但两者差异均无统计学意义. 随访12 wk时, 发生HBV DNA的患者抗病毒治疗前IFNGR1水平高于此时未发生阴转的患者IFNGR1水平, 两者差异有统计学意义(P<0.05, 表4).

表4 发生HBV DNA阴转的和未阴转的患者PBMCs表面IFNGR1比较.
分组HBV DNA阴转组(n = 29)HBV DNA未阴转组(n = 24)
基线组0.68±0.300.61±0.17
4 wk1.28±0.571.09±0.48
12 wk2.22±0.65a1.35±0.71
24 wk1.43±0.511.29±0.44
48 wk0.55±0.130.54±0.18
aP<0.05 vs 基线组. HBV: 乙型肝炎病毒; PBMCs: 外周血单个核细胞; IFNGR1: γ干扰素受体1.
3 讨论

CHB是由HBV感染引起的一种世界性疾病, HBV并不直接损害机体肝细胞, 而是改变了肝细胞的免疫原性, 导致机体对感染病毒的肝细胞产生免疫反应从而发生机体损害[13]. 目前认为慢性乙型肝炎的发生主要与HBV感染及原发或继发免疫功能低下、免疫调节功能紊乱有关. HBV感染者如不能对病毒产生足够的细胞免疫, 容易导致疾病慢性化. 而作为免疫系统中细胞间相互作用的信号分子, 一些细胞因子在整个肝细胞损伤的免疫应答和炎性反应中发挥着重要的作用[14].

多功能细胞因子IFN-γ是在免疫应答过程中由Th1和NK细胞产生的具有高度生物活性的一种细胞因子, 他可作为抗原提呈细胞和淋巴细胞增殖、分化的调节剂, 参与机体的炎症反应和抗病毒免疫[15]. 一般说来, IFN-γ可激发免疫效应细胞成熟和效应发挥, 包括活化T细胞或NK细胞来杀伤感染细胞; 活化巨噬细胞, 提高其对病毒感染细胞的细胞毒性作用; 诱导中性粒细胞参与特异性免疫反应等[16]. 本研究结果显示, CHB患者血清IFN-γ含量显著升高, 与Chen等[17]和李成德等[6]报道一致, 提示IFN-γ可能与CHB患者的肝脏炎症活动有关. 并且此时患者的免疫系统可能处于活动期, 机体的细胞免疫反应水平高则病毒清除有力, 病毒感染恢复快; 细胞免疫反应水平低则病毒清除无力, 病毒感染迁延不愈, 可导致乙型肝炎慢性化的进一步发展[18]. 在应用PEG-IFN-2a治疗后患者血清IFN-γ浓度下降, 提示其体内的炎症反应降低, 肝脏纤维化反应减轻, 延缓了疾病的进程. 但在治疗结束后患者血清IFN-γ浓度仍明显高于健康者, 提示此时患者体内可能仍存在炎症反应, 仍需继续监测其临床指标.

HBV是一种具有泛嗜性的双链DNA嗜肝病毒, 可感染人体各种组织和细胞. PBMCs作为淋巴细胞、巨噬细胞以及NK细胞等多种免疫细胞的集合体, 是仅次于肝细胞的HBV感染重要靶细胞. 许多研究[19]已表明乙型肝炎病毒能够感染PBMCs, 并通过影响其生长和分化代谢而造成免疫细胞功能紊乱. HBV感染形成病毒血症, 外周血也是免疫应答的重要场所, 除了巨噬细胞的直接吞噬作用, PBMCs分泌的一些细胞因子在清除体内病毒中也发挥着重要作用, IFN-γ就是其中之一. IFN诱导的过程实际上是一个信号传递和级联放大的过程, 其效应的发挥首先取决于细胞膜IFN-γ受体, 尤其是IFNGR1, 有研究[20]发现在IFN-γ受体缺乏HBsAg转基因小鼠动物模型中IFN-γ难以活化并发挥其生物学作用. 本实验应用实时荧光相对定量RT-PCR法检测CHB患者使用PEG-IFNα-2a治疗前后其PBMCs表面IFNGR1 mRNA的表达水平, 结果显示CHB患者IFNGR1的表达也高于健康对照组, 与Volpes等[21]报道一致. 在使用PEG-IFNα-2a治疗过程中, 发生HBV NDA阴转的患者PBMCs表面IFNGR1的表达高于HBV NDA未发生阴转患者, 在治疗12 wk时有统计学意义(P<0.05). 且在发生HBV NDA阴转的患者中, 其IFNGR1的表达水平在治疗后呈上升趋势, 在治疗12 wk时达到高峰, 之后开始下降. 至治疗结束, 其水平低于治疗前, 提示IFNGR1的表达水平与干扰素应答有关, 而治疗12 wk时患者PBMCs表面的IFNGR1表达水平可能作为干扰素抗乙型肝炎病毒治疗早期预测干扰素疗效的因子.

干扰素是目前公认的治疗CHB较为有效的药物, 且在CHB患者抗HBV治疗中的优势日益突出, 想要达到停药后仍能持久控制病毒复制和肝炎的复发, 干扰素治疗是首选[22]. 但其总体抗病毒疗效并不理想, 临床治疗疗效个体差异较大, 并且目前没有较好的指标能够预测其抗病毒疗效. 本实验结果表明, 慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ及PBMCs表面IFNGR1表达异常, 且在使用PEG-IFNα-2a抗病毒治疗过程中, CHB患者PBMCs表面IFNGR1表达水平与其抗病毒疗效也具有一定的相关性. 总之, 在临床工作中对乙型肝炎患者血清IFN-γ及PBMCs表面IFNGR1的表达进行监测, 可了解CHB患者的病情发展程度, 对指导干扰素等药物的临床应用, 免疫调节治疗等有重要临床价值.

评论
背景资料

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是长期影响人类健康的一大难题. 乙型肝炎病毒感染的慢性化与机体免疫调控紊乱密切相关. 大量研究资料表明, 慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)表达和分泌水平异常. IFN-γ作为重要的细胞因子, 在抗HBV中发挥重要的生物学作用.

研发前沿

CHB患者的免疫应答及免疫调节是HBV感染研究领域的热点, 在细胞因子与疾病的发展过程中起着非常重要的作用. 细胞因子IFN-γ因其独特的生物学作用日益受到人们重视.

相关报道

大量研究资料表明, 慢性HBV感染者IFN-γ表达和分泌水平异常. γ干扰素受体1(interferon gamma receptor 1, IFNGR1)是IFN-γ信号的主要通路, 有研究发现在IFN-γ受体缺乏HBsAg转基因小鼠动物模型中IFN-γ难以活化并发挥其生物学作用.

创新盘点

本文在聚乙二醇干扰素α-2a(polyethylene glycol interferon α-2a, PEG-IFNα-2a)治疗的不同时间点监测慢性乙型肝炎患者及健康对照组血清IFN-γ浓度及其外周血单个核细胞表面IFNGR1的表达, 综合分析治疗效果, 为临床了解CHB患者病情发展程度及指导干扰素等药物的临床应用提供依据.

应用要点

本文观察PEG-IFNα-2a对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞表面IFNGR1的影响, 综合分析治疗效果, 为肝炎病毒的治疗和预后提供依据, 同时对于干扰素的使用有一定的指导意义.

名词解释

IFNGR1: γ干扰素受体1, 是IFN-γ信号的主要通路, IFN-γ生物学作用的发挥以来与IFNGR1的结合.

同行评议者

程书权, 教授, 主任医师, 研究生导师, 桂林医学院第三附属医院(桂林市传染病医院, 桂林市第三人民医院)肝病科; 高月求, 教授, 主任医师, 博士生导师, 上海中医药大学附属曙光医院中医肝病

同行评价

本文是偏于临床的基础研究, 有一定借鉴价值.

手稿来源: 自由投稿

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 江苏省

同行评议报告分类

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编辑:马亚娟 电编:李瑞芳

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