修回日期: 2015-12-21
接受日期: 2016-01-19
在线出版日期: 2016-02-28
目的: 观察miR-409-3b对胃癌细胞侵袭转移的影响, 探讨miR-409-3b通过下调表皮生长因子蛋白7(epidermal growth factor like domain protein 7, EGFL7)调节胃癌侵袭和转移的具体机制.
方法: 通过基因芯片技术筛选出胃癌及癌旁组织差异性表达的微小RNA(microRNA, miRNA); 采用生物学信息学技术预测EGFL7调控相关miRNA, 通过对比上述结果, 筛选出miR-409-3b; 进一步以miR-409-3b慢病毒及miR-409-3b mimics过表达miR-409-3b后, 用Western blot检测胃癌细胞中的EGFL7的表达变化; 采用Transwell侵袭实验及划痕实验检测miR-409-3b慢病毒感染后细胞体外侵袭能力的变化; qRT-PCR检测80例胃癌患者癌组织和癌旁组织中miR-409-3b的表达差异, 并分析miR-409-3b的表达与胃癌患者临床病理之间的关系.
结果: 基因芯片及生物信息学预测发现miR-409-3b在胃癌组织中低表达, 同时又可能调控EGFL7, 双荧光素酶实验证实miR-409-3b可以结合在EGFL7上, miR-409-3b慢病毒及miR-409-3b mimics过表达miR-409-3b都能在蛋白水平下调EGFL7; miR-409-3b家族3条miRNA的qRT-PCR结果表明癌旁组织相对含量高于胃癌组织; Transwell侵袭实验结果表明: miR-409-3b与感染空载慢病毒相比感染能显著降低胃癌细胞穿的能力. 体外划痕实验的结果表明, 经LV-miR-409-3b感染空载慢病毒比BGC-823细胞的迁移能力明显升高. 进一步统计结果表明, miR-409-3b与淋巴结转移有关(P<0.05), miR-409-3b的C/P值在无远处转移的病例组织比具有远处转移的病例组织中明显升高(P<0.05).
结论: miR-409-3b可以在转录后水平调控EGFL7的表达, 从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移.
核心提示: 本文观察miR-409-3b对胃癌细胞侵袭转移的影响, 得出miR-409-3b可以在转录后水平下调表皮生长因子蛋白7(epidermal growth factor like domain protein, multiple7)的表达, 从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移.
引文著录: 计钰亮, 朱建华, 杨君寅. miR-409-3b通过下调表皮生长因子蛋白7抑制胃癌侵袭和转移的分子机制. 世界华人消化杂志 2016; 24(6): 866-872
Revised: December 21, 2015
Accepted: January 19, 2016
Published online: February 28, 2016
AIM: To investigate the inhibitory effect of miR-409-3b on the invasion and migration of gastric adenocarcinoma and the underlying molecular mechanisms.
METHODS: MicroRNA array was used to screen miRNAs which were significantly differentially expressed between gastric cancer and paracancerous tissue. Bioinformatics was employed to predict the miRNAs related to the regulation of epidermal growth factor-like domain-containing protein 7 (EGFL7). Gastric cancer cells were infected with lentiviral vectors or transfected with miR-409-3b mimics to overexpress miR-409-3b. Western blot was used to detect the changes of EGFL7 in gastric cancer cells. Transwell invasion assay was accomplished to analyze cell invasion ability. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was adopted to detect the expression of miR-409-3b in 80 pairs of gastric cancer tissues and adjacent noncancerous tissues. The relationship between clinical pathological data and EGFL7 expression was analyzed.
RESULTS: MicroRNA array and bioinformatics prediction results supported that miR-409-3b was lowly expressed in gastric carcinoma, and regulated EGFL7. Dual luciferase assay confirmed that miR-409-3b binds to EGFL7. Western blot analysis suggested that EGFL7 was downregulated after miR-409-3b overexpression. qRT-PCR suggested that the relative expression of miR-409-3b in gastric cancer tissues was lower than that in the adjacent noncancerous tissues. Transwell invasion experiments showed that miR-409-3b infection could significantly reduce the invasion ability of gastric cancer cells in vitro. The migration ability of miR-409-3b LV-cells was significantly higher than that of BGC-823 cells. The expression of miR-409-3b was closely related with lymph node metastasis (P < 0.05). The expression ratio of miR-409-3b in gastric cancer tissues to adjacent noncancerous tissues was significantly lower in tissues collected from patients with distant metastasis than in those from patients without distant metastasis (P < 0.05).
CONCLUSION: miR-409-3b regulates EGFL7 expression at the post-transcriptional level, and then suppresses the invasion and metastasis of gastric adenocarcinoma.
- Citation: Ji YL, Zhu JH, Yang JY. miR-409-3b inhibits invasion and metastasis of gastric cancer by downregulating EGFL7 protein expression. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2016; 24(6): 866-872
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v24/i6/866.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v24.i6.866
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一, 最新数据显示其发病率及死亡率高居恶性肿瘤前列, 导致了重大的公共健康负担. 虽然对胃癌的治疗取得了显著的进步, 使患者的总体生存期得以提高, 但是复发和转移使胃癌患者的5年生存率仍然很低. 而且大多数新诊断的胃癌患者已表现为转移性疾病, 这使得对胃癌的治疗仍然是肿瘤学中的重要难题之一. 近年来发现: 表皮生长因子蛋白7(epidermal growth factor-like domain-containing protein 7, EGFL7)可明显增强细胞运动迁移能力, 是重要的运动刺激因子和肿瘤转移相关因子[1]. EGFL7是一种内皮细胞源性的调节血管形成的分泌因子. 最近的研究报道显示, EGFL7在多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中表达, 包括肾癌、恶性神经胶质瘤, 肝癌和结肠癌. EGFL7可能作为预测癌症进展和转移的新分子标记. 然而他在胃癌中的具体作用机制目前尚不清楚, 有必要进行下一步深入研究[2-4].
EGFL7在胃癌转移和侵袭中起着重要的作用, 但胃癌中调节EGFL7分泌的机制尚不清楚. 近年来研究表明一种微小RNA(microRNA, miRNA), 通过负性调节靶基因表达, 可在多种疾病病理过程起重要作用. 并且一些miRNA已经被证实与肿瘤发生、发展及转移相关. 但在胃癌中EGFL7如何被调控尚未得到证实[5-7]. 因此我们推测还有另外miRNA参与EGFL7转录后的调控. 我们利用基因芯片技术检测胃癌组织以及癌旁组织的miRNA表达差异, 并结合生物信息学的预测结果, 初步筛选miR-409-3b可能调节EGFL7又在胃癌中低表达的miRNA分子. 并在此基础上, 本文探究miR-409-3b在癌旁正常胃黏膜组织和胃癌组织中的临床病理学特征的关系及表达差异, miR-409-3b对EGFL7表达的调控及其对胃癌细胞生物学特征影响, 以期为研究胃癌的转移和侵袭提供理论依据[8-10].
选取80例于2014-04/12在嘉兴医院普外科住院的胃腺癌患者. 患者中男性38例, 女性42例, 平均年龄53.6岁, 所有患者均签署了知情同意书, 所有病例分别取癌组织(C组)和癌旁组织(P组, 距癌组织距离>5 cm)[1]. 胃腺癌细胞(BGC-823、MKN-28、SGC-7901)均为本实验室保存. 试剂与仪器: miR-409-3b慢病毒(上海吉凯基因化学有限公司); miR-409-3b mimics(广州市锐博生物科技有限公司); TRIzol、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(TaKaRa公司, 日本); miR-409-3b及U6特异RT及PCR引物(广州市锐博生物科技有限公司); 双荧光素酶试剂盒(Promega公司, 美国); 基质胶Transwell小室(Santa cruz公司, 美国); DMEM高糖培养基与胎牛血清(abcam公司, 美国); miR-409-3b慢病毒(LV-miR-409-3b)及对照(LV-NC, 中杉金桥公司); Cell Lysis Buffer(北京碧云天生物科技有限公司); β-actin及辣根过氧化物酶偶联的二抗(抗兔、抗小鼠、抗羊)均购自美国abcam公司; EGFL7抗体购自Cell Signaling公司Transwell小室(BD公司).
1.2.1 细胞培养: 人胃腺癌(BGC-823、MKN-28、SGC-7901)细胞用含10%胎牛血清DMEM高糖培养液, 在37 ℃、50 mL/L CO2的培养箱中连续培养, 3-4 d后传代.
1.2.2 qRT-PCR检测: qRT-PCR法检测miR-409-3b表达将BGC-823、MKN-28、SGC-7901细胞密度调整为1×105/mL接种于6孔板中, 待细胞贴壁后进行实验干预. 提取细胞的miRNA做qRT-PCR, 以U6为内参, U6、miR-409-3b引物序列: U6-forward: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3', U6-reverse: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'; miR-409-3b-forward: 5'-TATATCCAGCTGGGTGCTAATTTGCCG-3', universal primer TGGTGTCGTGGATAC. 使用Transgen Biotech公司qPCR and qRT-PCR SuperMix, Bio-Rad公司CFX, 每组3个复孔, 反应条件为: 94 ℃ 30 s, 94 ℃ 5 s, 55 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 共45个循环. 由仪器配套专用软件进行结果分析, 通过与内参对比检测各组细胞中miR-409-3b的表达情况.
1.2.3 Western blot法检测EGFL7蛋白: 将BGC-823、MKN-28、SGC-7901细胞密度调整为1×105/mL接种于6孔板中, 待细胞贴壁后进行干预实验. 继续培养48 h, 收集细胞, Cell Lysis Buffer裂解后检测EGFL7蛋白表达.
1.2.4 Transwell体外侵袭实验: Transwell法检测细胞侵袭能力 用无血清的RPMI 1640培养基5:1稀释Matrigel后取40 µL稀释液均匀铺在Transwell小室的上室, 37 ℃作用30 min备用. 将预处理的细胞消化制成细胞悬液5×105个/mL, 上室中每孔加入细胞悬液400 µL, 下室中加入600 µL RPMI 1640培养基, 并在下室另加入10%胎牛血清50 µL, 36 h后, 用棉签擦去Matrigel和上室内细胞, 4%多聚甲醛固定10 min, 结晶紫染色, PBS洗去多余染料, 随机选取视野进行拍照计数, 以上实验随机重复3次.
1.2.5 miRNA芯片分析: 将胃癌组织和癌旁正常组织送武汉谷歌生物公司做miRNA基因芯片分析, 检测两种组织中miRNA分子表达差异.
1.2.6 划痕实验: 将细胞接种于6孔培养板, 每组设3复孔, 等细胞生长至100%融合, 用无菌移液器枪头沿培养板底部呈"1"字形划痕, 用PBS洗掉脱落细胞, 倒置显微镜下记录划痕区相对距离, 然后放入培养箱培养48 h, 每隔12 h显微镜下观察划痕修复情况1次, 实验重复3次.
统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行分析, 计量数据用mean±SD表示, 组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), P<0.05认为差异有统计学意义.
miRNA芯片结果表明, 共有475条miRNA在癌旁组织和胃癌组织的表达有差异.
对EGFL7调控的miRNA分子预测, 发现miR-409-3b为在胃癌组织里低表达的miRNA并可能调控EGFL7.
EGFL7在3株胃癌细胞表达水平明显低于癌旁组织, 当用miR-409-3b慢病毒过表达miR-409-3b后得到相似的结果(图1).
Transwell侵袭实验结果表明: miR-409-3b与感染空载慢病毒相比感染能显著降低胃癌细胞穿膜的能力(图2). 体外划痕实验的结果表明, 经LV-miR-409-3b感染空载慢病毒比BGC-823细胞的迁移能力明显升高(图3).
收集80例胃癌组织、癌旁组织标本, 利用qRT-PCR检测胃癌组织和癌旁组织miR-409-3b miRNA分子的表达水平. qRT-PCR结果表明miR-409-3b在癌旁组织相对含量高于胃癌组织. 分析miR-409-3b在胃癌组织和癌旁组织中相对表达含量的比值(C/P)与年龄、性别、淋巴结转移、远处转移、TMN分期、浸润深度、分化程度、肿瘤直径之间的关系. 实验结果表明miR-409-3b在无淋巴结转移的病理组织中C/P比值较有淋巴结转移的病理组织明显升高(P<0.05); miR-409-3b在无远处转移的病理组织中C/P比值较有远处转移的病例组织明显升高(P<0.05); 而miR-409-3b与肿瘤的远处转移的差异无统计学意义(P = 0.148)(表1).
| 临床病理参数 | miR-409-3b | |
| C/P | P值 | |
| 性别 | 0.701 | |
| 男 | 0.96±0.30 | |
| 女 | 0.71±0.12 | |
| 年龄(岁) | 0.681 | |
| >60 | 0.94±0.33 | |
| <60 | 0.63±0.13 | |
| 淋巴结转移 | <0.010 | |
| 有 | 0.59±0.04 | |
| 无 | 1.20±0.03 | |
| 远处转移 | 0.900 | |
| 有 | 0.79±0.14 | |
| 无 | 0.81±0.11 | |
| TMN分期 | 0.921 | |
| Ⅰ/Ⅱ | 1.23±0.35 | |
| Ⅲ/Ⅳ | 0.62±0.11 | |
| 肿瘤直径(cm) | 0.173 | |
| <5 | 1.02±0.24 | |
| >5 | 0.39±0.11 | |
| 浸润深度 | 0.865 | |
| 未穿透浆膜 | 0.79±0.40 | |
| 穿透浆膜 | 0.54±0.17 | |
| 分化程度 | 0.711 | |
| 低分化 | 0.86±0.30 | |
| 中、高分化 | 0.35±0.07 | |
胃癌为全球发病率最高的恶性肿瘤之一, 胃癌的侵袭转移是患者死亡和治疗效果不佳的最主要原因[8]. 而侵袭转移是一个多阶段、多步骤、多个因素共同参与调控的生物学过程, 基本过程包括: 首先癌细胞脱离原发灶、其次癌细胞进入循环系统(淋巴循环和血液循环)、侵袭靶器官、远处定植和新生血管形成, 最终导致转移灶的形成[8]. 胃癌的侵袭转移牵涉到多个因素、蛋白和基因多方面的调节[11,12]. miRNAs小分子是在真核生物中发现内源性的具有调控功能的一类非编码RNA, 可通过和靶mRNA互补配对导致mRNA降解或抑制转录后蛋白翻译并最终导致基因沉默[13]. 研究证实miRNA参与一系列的重要的生物学进程, 包括生长发育、细胞分化、组织器官形成、细胞凋亡和癌症的发生及侵袭转移等. 研究[14-16]表明, miRNAs与多种恶性肿瘤的发生及侵袭转移密切相关. 因此miRNAs的研究[17-19]有可能成为判断肿瘤治疗及预后的分子靶点和诊断肿瘤的新的分子标志, 并有助于肿瘤的早发现、早诊断和早治疗.
研究发现EGFL7蛋白包括一个信号肽, 一个EMI结构域、一个EGF结构域、一个EGF-CA结构域以及一个富含亮氨酸、缬氨酸的羧基端. EGFL7在肿瘤中研究常见, 但与miR-409-3b相关研究较为少见[18].
近年来, miR-409-3b被发现可以调控肿瘤细胞多个生物学过程, 包括细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等. 研究显示[20], miR-409-3b可以抑制多种不同实体肿瘤如纤维肉瘤、肺腺癌和膀胱癌的转移. 如miR-409-3b可通过下调c-MET的表达而抑制肺腺癌和膀胱癌的转移[21-23]. 但因技术手段的局限, 本文通过改进传统miRNA作用机制研究策略, 全面揭示miR-409-3b调控胃癌转移的作用机制[20].
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一, 大多数新诊断的胃癌患者已表现为转移性疾病, 这使得对胃癌的治疗仍然是肿瘤学中的重要难题之一. 表皮生长因子蛋白7(epidermal growth factor-like domain-containing protein 7, EGFL7)可明显增强细胞运动迁移能力, 是重要的运动刺激因子和肿瘤转移相关因子.
沙杰, 副主任医师, 江苏省靖江市人民医院消化科
近年来研究表明一种微小RNA(microRNA, miRNA)通过负性调节靶基因表达, 可在多种疾病病理过程起重要作用. 并且一些miRNA已经被证实与肿瘤发生、发展及转移相关. 但在胃癌中EGFL7如何被调控尚未得到证实.
本文探究miR-409-3b在癌旁正常胃黏膜组织和胃癌组织中的临床病理学特征的关系及表达差异, miR-409-3b对EGFL7表达的调控及其对胃癌细胞生物学特征影响, 以期为研究胃癌的转移和侵袭提供理论依据.
本文探究miR-409-3b在癌旁正常胃黏膜组织和胃癌组织中的临床病理学特征的关系及表达差异, miR-409-3b对EGFL7表达的调控及其对胃癌细胞生物学特征影响, 具有一定的意义.
编辑:郭鹏 电编:闫晋利
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