研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2016-04-18; 24(11): 1708-1713
在线出版日期: 2016-04-18. doi: 10.11569/wcjd.v24.i11.1708
GCS通过影响bcl-2的表达介导结肠癌细胞的多药耐药
宋敏, 韩雪, 任秀花, 孟宇, 张顺同
宋敏, 韩雪, 孟宇, 张顺同, 郑州大学第一附属医院肿瘤科 河南省郑州市 450052
任秀花, 郑州大学基础医学院人体解剖学教研室 河南省郑州市 450001
宋敏, 主要从事消化系肿瘤的基础与临床方面的研究.
作者贡献分布: 此课题由宋敏、韩雪及孟宇设计; 研究过程由韩雪与张顺同完成; 任秀花负责实验指导; 宋敏与孟宇负责论文指导与修改; 数据分析和论文撰写由韩雪完成.
通讯作者: 宋敏, 教授, 主任医师, 450052, 河南省郑州市二七区建设路1号, 郑州大学第一附属医院肿瘤科. minsong2011@163.com
收稿日期: 2016-01-27
修回日期: 2016-03-07
接受日期: 2016-03-13
在线出版日期: 2016-04-18

目的: 本文旨在通过检测在不同条件下结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR及其敏感株细胞HCT-8中葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase, GCS)、bcl-2及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的表达, 探讨其相互关系及可能的作用机制.

方法: 将细胞分为3组, A组: 结肠癌敏感细胞HCT-8常规培养; B组: 耐药细胞HCT-8/VCR加VCR 1 μg/mL培养, 维持其耐药性; C组: GCS抑制剂PPMP处理耐药细胞HCT-8/VCR. Western blot检测各组细胞中GCS、bcl-2及ERK蛋白水平的表达. 实时定量PCR检测(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测GCS、ERK、bcl-2基因表达情况.

结果: 与敏感细胞相比, 多药耐药(multidrug resistance, MDR)细胞中GCS与bcl-2的mRNA和蛋白表达量明显升高(P<0.05), PPMP处理HCT-8/VCR细胞, GCS蛋白和mRNA的表达受到明显抑制(P<0.05), 同时bcl-2蛋白及mRNA的表达也明显下降(P<0.05), ERK蛋白的表达量在加入PPMP后也较前下降(P<0.05).

结论: GCS通过影响抗凋亡蛋白bcl-2的表达, 从而介导结肠癌细胞MDR, 这一过程可能是通过ERK信号通路完成的. 加入GCS抑制剂PPMP, 可抑制bcl-2的表达, 逆转细胞耐药.

关键词: 葡萄糖神经酰胺合成酶; 结肠癌; 多药耐药; 细胞外调节蛋白激酶

核心提示: 肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)与细胞中葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase, GCS)含量的变化有着密切的关系, 实验通过干预并观察耐药组与非耐药组细胞中GCS、bcl-2、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)蛋白及基因表达的变化, 推断GCS通过ERK信号通路调节bcl-2的表达, 从而介导细胞耐药, 为进一步研究肿瘤MDR提供理论依据.
引文著录: 宋敏, 韩雪, 任秀花, 孟宇, 张顺同. GCS通过影响bcl-2的表达介导结肠癌细胞的多药耐药. 世界华人消化杂志 2016; 24(11): 1708-1713
Glucosylceramide synthase induces multidrug resistance by regulating bcl-2 expression in human colon cancer cells
Min Song, Xue Han, Xiu-Hua Ren, Yu Meng, Shun-Tong Zhang
Min Song, Xue Han, Yu Meng, Shun-Tong Zhang, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, He'nan Province, China
Xiu-Hua Ren, Department of Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, He'nan Province, China
Correspondence to: Min Song, Professor, Chief Physician, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 1 Jianshe Street, Erqi District, Zhengzhou 450052, He'nan Province, China. minsong2011@163.com
Received: January 27, 2016
Revised: March 7, 2016
Accepted: March 13, 2016
Published online: April 18, 2016

AIM: To investigate the relationship between glucosylceramide synthase (GCS) and bcl-2 in human colon cell line HCT-8 and multidrug resistant (MDR) cell line HCT-8/VCR, in order to explore their role in multidrug resistance of colon cancer cells.

METHODS: The study contained three groups: normally cultured HCT-8 cells (group A), HCT-8/VCR cells treated with VCR to maintain the drug resistance (group B), and HCT-8/VCR cells treated with VCR and inhibitor of GCS (PPMP) (group C). Expression of GCS, bcl-2, and extracellular regulated protein kinases (ERK) proteins was detected by Western blot. Expression of GCS, bcl-2, and ERK mRNAs was tested by real-time quantitative PCR (qRT-PCR).

RESULTS: Compared with HCT-8 cell line, expression of GCS, ERK and bcl-2 proteins and mRNAs was higher in MDR cell line. After treatment with PPMP, expression of those proteins and mRNAs were obviously restrained in HCT-8/VCR cell line.

CONCLUSION: GCS induces multidrug resistance by regulating the expression of bcl-2, and this process may involve ERK signaling pathway. The inhibitor of GCS (PPMP) can inhibit the expression of bcl-2 and reverse multidrug resistance in human colon cancer cell line.

Key Words: Glucosylceramide synthase; Colorectal cancer; Multidrug resistance; Extracellular regulated protein kinases
0 引言

结直肠癌是最常见的消化系恶性肿瘤之一, 在我国的发病率和死亡率分别位于第3位和第4位, 且呈逐年上升的趋势[1,2]. 化疗是终末期结肠癌的治疗的主要方法, 然而, 肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是化疗失败的主要原因之一. 近年来, 神经酰胺途径在肿瘤MDR形成中的作用越来越受到关注, 葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase, GCS)是一种葡萄糖转移酶, 能使神经酰胺糖基化形成葡萄糖神经酰胺(GlcCer), 从而使肿瘤细胞逃避由神经酰胺途径介导的凋亡作用. GCS与肿瘤MDR的关系已在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌及白血病等多种肿瘤细胞中得到证实. 细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信号通路在调节细胞生存方面发挥重要作用, 与bcl-2关系密切, ERK信号通路异常可导致细胞凋亡减少, 引起细胞的耐药.

1 材料和方法
1.1 材料

人结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR购自中南大学湘雅医学院细胞中心, 郑州大学人体解剖学教研室传代培养. HCT-8细胞由郑州大学人体解剖学教研室保存. RPMI-1640培养基购自日本Hyclone公司. 特级胎牛血清购自美国GEMINI公司. bcl-2、β-actin一抗及羊抗兔IgG、兔抗鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司. GCS一抗购自Abcam公司. ERK1/2一抗购自Proteintech公司. PPMP购自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: HCT-8/VCR及HCT-8细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100 U/mL)中, 在37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度培养箱中常规培养. HCT-8/VCR细胞的长春新碱维持浓度为1.0 μg/mL. 实验在脱药培养2 wk, 取对数期生长良好的细胞进行.

1.2.2 PPMP处理细胞: 将PPMP溶解成10 mmol/L的初始溶液, -20 ℃保存. 使用时用RPMI-1640培养基稀释成终浓度为20 μmol/L的溶液, 加入细胞中, 再培养48 h.

1.2.3 Western blot分析相关蛋白的表达: 蛋白提取: 取对数期HCT-8及HCT-8/VCR细胞, RIPA裂解液提取细胞总蛋白, BCA法检测蛋白含量, 作为Western blot实验材料备用. Western blot: 蛋白经12%SDS-PAGE分离, 转移到PVDF膜上. 用含5%脱脂奶粉的TBST封闭, 室温1 h. 加入适当浓度一抗, 4 ℃孵育过夜. TBST清洗3遍, 用适当浓度二抗孵育, 室温2 h. TBST清洗后ECL发光显影.

1.2.4 实时定量PCR检测检测相关mRNA表达: 根据GenBank中所查GCS、bcl-2、ERK和β-actin的序列设计引物, 经BLAST对比确认后, 由上海生工合成. 各引物序列如表1所示. RNA提取及实时定量PCR检测(real-time quantitative PCR, qRT-PCR): 用TRIzol法提取各组细胞总RNA, 测浓度, -80 ℃保存备用. 取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性. 用TIANScript RT KIT进行反转录, 实验操作按产品说明书进行. 用qRT-PCR仪, 采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析. 反应体系: 预变性阶段: 95 ℃ 15 min; PCR反应阶段: 变性95 ℃ 10 s; 退火58 ℃ 30 s; 延伸72 ℃ 30 s. 40个循环. 分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增. 同时在60 ℃-95 ℃进行溶解曲线分析.

表1 引物序列.
引物名称序列产物长度(bp)
GCS FP: 5'-CACCCGATTACACCTCAA-3' 414
RP: 5'-CCGTGAACCAAGCCTACT-3'
Bcl-2 FP: 5'-CAGAGGGGATACGAGTG-3' 85
RP: 5'-GCTGCGAGGAGAAGATG-3'
ERK FP: 5'-CTTCTCGCCTCAGTTCGC-3' 148
RP: 5'-GTCCAGGATCACGCCATT-3'
β-actin FP: 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3' 205
RP: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'

统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析, 统计图采用Origin7.5绘制. 所有数据均用mean±SD来表示. 多组数据之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA), 若不符合正态性或者方差齐性, 则用非参数检验(Kruskal-Wallis test), 若有统计学意义, 再用LSD-t检验, P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结果
2.1 Western blot检测GCS、ERK及bcl-2蛋白表达情况

亲本细胞HCT-8常规培养, MDR细胞HCT-8/VCR加VCR培养, PPMP处理HCT-8/VCR细胞48 h后提取蛋白, Western blot检测3组细胞中GCS与bcl-2的蛋白表达量(图1A). 与敏感细胞相比, 耐药细胞HCT-8/VCR中GCS及抗凋亡蛋白bcl-2的表达明显升高(P<0.05). PPMP作用48 h后, GCS的表达受到明显抑制(P<0.05), 同时bcl-2的表达也较前下降(P<0.05)(图1B). Western blot检测3组细胞ERK及抗凋亡蛋白bcl-2的表达其情况(图1C), 结果显示, 耐药细胞ERK及bcl-2表达明显高于亲本(P<0.05), PPMP处理后, ERK及bcl-2的表达均较前下调(P<0.05)(图1D).

图1
图1 HCT-8, HCT-8/VCR和PPMP处理后HCT-8/VCR 3组细胞中GCS、ERK和bcl-2蛋白的表达量. A: GCS和bcl-2条带图; B: GCS和bcl-2表达量; C: ERK和bcl-2条带图; D: ERK和bcl-2表达量. aP<0.05 vs HCT-8组; cP<0.05 vs HCT-8/VCR+PPMP组. GCS: 葡萄糖神经酰胺合成酶; ERK: 细胞外调节蛋白激酶.
2.2 qRT-PCR检测GCS及bcl-2基因表达情况

HCT-8结肠癌敏感细胞株常规培养, MDR细胞HCT-8/VCR加VCR培养, 另一组HCT-8/VCR细胞PPMP处理48 h, 提取RNA, qRT-PCR测3组细胞中GCS和bcl-2 mRNA表达情况, 结果显示, 耐药细胞中GCS、bcl-2及ERK基因表达量明显高于敏感细胞株(P<0.05), PPMP处理后, 3组基因表达较前下降(P<0.05)(图2).

图2
图2 荧光定量PCR检测3组细胞中GCS、bcl-2及ERK 3种基因表达情况. aP<0.05 vs HCT-8组; cP<0.05 vs HCT-8/VCR+PPMP组. GCS: 葡萄糖神经酰胺合成酶; ERK: 细胞外调节蛋白激酶.
3 讨论

时至今日, 全身化疗仍是晚期结肠癌的主要治疗手段, 而MDR的发生是导致恶性肿瘤化疗失败的主要原因之一. 肿瘤细胞的MDR可以是先天性的, 也可以是获得性的, 而MDR的形成也是由多种因素共同参与, 如ABC转运蛋白P-gp等对化疗药物的转运作用、谷胱甘肽S转移酶对药物的灭活和解毒作用、信号通路中蛋白的异常或凋亡抑制等.

近年来, 神经酰胺在肿瘤发生发展中的作用越来越受到关注. 神经酰胺不仅是鞘脂类代谢的重要中间产物, 也作为重要的细胞内信号分子, 参与细胞的生长增殖及凋亡. 普遍认为, 在肿瘤细胞中, 神经酰胺的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用具有重要意义. 治疗肿瘤的常用手段放疗及化疗, 能使细胞内神经酰胺合成增加, 从而增强放化疗的抗肿瘤作用[3], 一些化疗药物, 如顺铂、阿霉素等, 与神经酰胺具有协同作用, 共同促进肿瘤细胞的凋亡. 研究[4]证明, 索拉菲尼可增加肝细胞中神经酰胺的含量, 同时使神经酰胺相关代谢酶的表达上调.

GCS是神经酰胺代谢的一种常见酶, 催化UDP-葡萄糖上的葡萄糖基与神经酰胺结合, 形成葡萄糖神经酰胺(GlcCer), GlcCer失去了神经酰胺抗凋亡的作用, 并参与合成不同种类的鞘糖酯(GSLs), 这些GSLs参与调节细胞的增殖、分化以及细胞间相互作用, 在肿瘤细胞转移扩散中起着重要作用[5,6]. 若减少细胞内UDP-葡萄糖的含量, 能有效增加神经酰胺介导的细胞凋亡[7]. 细胞内GCS水平提高与肿瘤细胞MDR之间的关系越来越受到关注, 越来越多研究[8,9]表明: 细胞内GCS水平的提升是肿瘤细胞逃避化疗药物毒性的重要途径之一. 在肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌和白血病等多种耐药肿瘤细胞中, 均检测到GCS表达的升高[10], 且伴有耐药基因MDR1及P-gp表达的升高[11,12].

化疗药物引起的细胞凋亡是正常的程序性死亡, 作为最早发现的抗凋亡蛋白, bcl-2作用于细胞凋亡的下游共同通路, 是调控细胞凋亡的关键蛋白. 在细胞中, 抗凋亡蛋白与凋亡蛋白的比例(即bcl-2/bax), 决定着细胞的发展方向: 凋亡或生长[13,14]. 因此, 各种原因引起的细胞中bcl-2的表达的变化, 均能影响肿瘤细胞的凋亡, 肿瘤细胞中bcl-2的过表达也是导致细胞MDR的原因之一, 用siRNA沉默乳腺癌细胞中的bcl-2 mRNA, 可增加细胞对他莫昔芬的敏感性[15], Wang等[16]的研究也证明, 在白血病耐药细胞中, bcl-2的表达明显升高, 且与GCS的表达也具有一致性.

ERK信号通路是细胞内常见信号转导通路, 参与调解肿瘤细胞的生长、分化及转移. ERK的高表达, 可以诱导bcl-2、bcl-xl等抗凋亡基因的表达, 并可以促进bcl-2的磷酸化而发挥抗凋亡作用[17]. 吉西他滨能促进胰腺癌细胞中ERK的活化, 引起细胞凋亡减少, 通过抑制ERK蛋白, 可增加凋亡蛋白bax的表达, 同时抗凋亡蛋白bcl-2表达下调, 促进由吉西他滨引起的细胞凋亡[13].

本研究为探讨结肠癌细胞中GCS与抗凋亡蛋白的相互关系及可能的机制, 选择了结肠癌细胞株HCT-8及其耐药株HCT-8/VCR, 检测两组细胞GCS及bcl-2的表达情况, 结果显示, 在HCT-8细胞及其MDR细胞HCT-8/VCR中均有GCS的表达, 但在耐药细胞株中, GCS的表达量明显高于其敏感株(P<0.05), 同时, bcl-2在耐药株的表达量也明显高于亲本, 与GCS的表达具有一致性. qRT-PCR结果显示, GCS mRNA与bcl-2 mRNA在耐药株HCT-8/VCR的表达量也高于敏感株细胞, 差异显著(P<0.05). 加入GCS抑制剂PPMP后, 使HCT-8/VCR细胞中GCS基因及蛋白表达量下降, 相应地, bcl-2基因和蛋白表达也显著下调. 结果提示, 抗凋亡蛋白bcl-2受到细胞中GCS表达的影响, 调控细胞凋亡. 同时对细胞中ERK蛋白进行检测, 结果显示, 在耐药细胞株中, ERK蛋白表达量明显高于敏感株, 加入PPMP后, ERK蛋白表达量较前下降, 与GCS及bcl-2表达一致, 提示ERK蛋白参与GCS调节bcl-2表达的过程.

结合本实验研究结果, 我们推测, GCS能够调节ERK信号通路, 并影响抗凋亡蛋白bcl-2的表达, 或许可以通过抑制ERK信号通路下调抗凋亡蛋白bcl-2的表达, 逆转肿瘤细胞耐药, 这一推测还有待进一步验证.

评论
背景资料

结直肠癌是最常见的消化系恶性肿瘤之一, 化疗是终末期结肠癌的治疗的主要方法, 但肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是化疗失败的主要原因之一. 葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase, GCS)与MDR的形成关系密切, 通过多种途径参与耐药的形成.

同行评议者

许庆文, 主任医师, 广东医学院附属医院普通外科

研发前沿

GCS参与的肿瘤细胞MDR是近年来肿瘤MDR研究的热点问题, 但关于结直肠肿瘤中GCS与凋亡相关蛋白间相互作用的研究甚.

相关报道

已有研究证实白血病耐药细胞中, GCS与bcl-2的表达升高, 且表达具有相关性; Wang等发现通过抑制细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)蛋白, 可增加凋亡蛋白bax的表达, 同时抗凋亡蛋白bcl-2表达下调, 促进由吉西他滨引起的细胞凋亡.

创新盘点

本文着重研究结肠癌耐药细胞中GCS与bcl-2的作用关系、可能涉及的信号通路及其与MDR的关系. 研究结果表明, GCS通过ERK信号通路调节bcl-2的表达, 从而介导细胞耐药.

应用要点

肿瘤细胞MDR是终末期结肠癌患者化疗失败的重要原因, 导致预后不良, 而GCS参与MDR的形成. 本研究阐述了GCS引起耐药的一条途径, 为进一步研究肿瘤MDR提供理论依据.

名词解释

GCS: 催化UDP-葡萄糖上的葡萄糖基与神经酰胺结合,使其转变成无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺(GlcCer); MDR: 是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时对其他从未接触的, 结构不同, 机制各异的其他化疗药物产生耐药.

同行评价

本文研究结肠癌耐药细胞中GCS与bcl-2的作用关系和涉及的信号通路, 能较好地反映我国结直肠癌基础研究的先进水平.

编辑:于明茜 电编:都珍珍

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