顺铂对结肠癌细胞株Caco-2增殖凋亡和Bcl-2、Caspase3、Caspase9蛋白表达的影响

摘要

目的: 探讨顺铂(顺式二氨二氯铂)(cis-dichlorodiamineplatinum, DDP)对人结肠癌Caco-2细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Caspase9、Caspase3表达的影响.

方法: 体外培养结肠癌Caco-2细胞; 检测不同浓度DDP干预下MTT染色的A值, 判定其对人结肠癌细胞恶性增殖的影响; 不同浓度DDP对人结肠癌细胞凋亡的影响使用流式细胞仪进行检测, Western blot检测不同浓度DDP对人结肠癌细胞内Bcl-2蛋白的表达; 应用分光光度法检测不同浓度DDP对人结肠癌细胞内Caspase9、Caspase3蛋白活性的影响.

结果: (1)癌细胞增殖结果显示, 在一定的作用时间范围内, Caco-2细胞存活率与DDP浓度呈负相关, 具有剂量依赖性, 其中4.000、2.000 µg/mL干预的各组细胞抑制率最显著, 差异均有统计学意义(P<0.05). 而低剂量组0.250、0.125 µg/mL及对照DMSO干预组细胞存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05), 其细胞存活率明显高于其他各浓度组, 差异有统计学意义(P<0.01); (2)流式细胞仪检测结果显示: DDP能诱导Caco-2细胞的凋亡, 其诱导凋亡的效果呈时间和剂量性依赖; (3)Western blot检测结果显示: Bcl-2蛋白在结肠癌Caco-2细胞中低表达, DDP干预Caco-2细胞72 h后, 与对照组比较, Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05). Caspase9、Caspase3在Caco-2细胞中低表达, DDP干预Caco-2细胞48、72 h后, 与对照组比较, Caspase9、Caspase3表达明显升高(P<0.01).

结论: 顺铂可以抑制Caco-2细胞增殖、诱导Caco-2细胞凋亡, 其机制可能与活化Caco-2细胞中Caspase9、Caspase3蛋白以及抑制Bcl-2蛋白表达有关.

关键词: 顺铂; 人结肠癌; Bcl-2; Caspase9; Caspase3; 细胞凋亡

核心提示: 顺铂可以抑制Caco-2细胞增殖、诱导Caco-2细胞凋亡, 其机制可能与活化Caco-2细胞中Caspase9、Caspase3蛋白以及抑制Bcl-2蛋白表达有关.

Effect of cisplatin on cell proliferation and apoptosis and expression of Bcl-2, Caspase3 and Caspase9 proteins in human colon carcinoma cell line Caco-2

Shi-Qing Li, Fu-Min Chen, Jun Luo, Long Chen, Man Qi

Shi-Qing Li, Fu-Min Chen, Jun Luo, Long Chen, the Second Clinical College of North Sichuan Medical College; Department of Gastroenterology, Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Correspondence to: Shi-Qing Li, Lecturer, the Second Clinical College of North Sichuan Medical College; Department of Gastroenterology, Nanchong Central Hospital, 97 Renmin South Road, Nanchong 637000, Sichuan Province, China. songman3423@126.com

Received: November 11, 2014
Revised: January 23, 2015
Accepted: January 30, 2015
Published online: March 28, 2015

Abstract

AIM: To investigate whether cisplatin induces the apoptosis of colon cancer Caco-2 cells and inhibits the expression of Bcl-2, Caspase9 and Caspase3.

METHODS: Caco-2 cells were treated with cisplatin. Cell proliferation was measured by MTT assay and fluorescence microscopy. The protein expression of Bcl-2 was determined by Western blot, and the protein expression of Caspase9 and Caspase3 was determined by spectrophotometry.

RESULTS: Cisplatin inhibited the proliferation of Caco-2 cells in a concentration-dependent manner, and the survival rates of cells treated with 4 and 2 µg/mL cisplatin showed a statistical difference (P < 0.01), although there was no significant difference between cells treated with l.0 and 0.5 µg/mL cisplatin (P > 0.05). Cisplatin induced the apoptosis of Caco-2 cells in a time- and dose-dependent manner. Bcl-2 protein was highly expressed in Caco-2 cells. Cisplatin intervention for 72 h significantly reduced the expression of Bcl-2 protein in Caco-2 cells compared with control cells (P < 0.05).The protein expression of Caspase9 and Caspase3 was significantly up-regulated at 48 and 72 h after treatment with cisplatin when compared with control cells (P < 0.01).

CONCLUSION: Cisplatin inhibits the proliferation and induces apoptosis of Caco-2 cells via mechanisms that may be related to activation of Caspase9 and Caspase3 and inhibition of Bcl-2 protein expression.

Key Words: Cisplatin; Colon cancer; Bcl-2; Caspase9; Caspase3; Cell apoptosis

0 引言

结肠癌是一种常见的消化系恶性肿瘤, 严重威胁着人们的健康. 结肠癌可以通过手术予以切除治疗, 但治疗后多半会出现复发和转移, 因此寻求到有效的抗癌药物成为结肠癌治疗的关键问题之一[1]. 在临床上的各种实体瘤的治疗中, 铂类药物使用最广泛且具有最佳的治疗效果[2,3]. 但是, 单独使用铂类药物具有明显的不良反应, 主要是因为铂类容易与核蛋白或者DNA交联, 形成DNA-蛋白质交联产物, 进而活化分裂原活化蛋白激酶、p53、p73和Bcl-2等众多细胞凋亡相关的通路, 引发细胞凋亡的发生或抑制细胞周期发生[4]. 为了研究顺铂对于人结肠癌细胞生长增殖的抑制作用, 我们做了该研究, 现汇报如下.

1 材料和方法

1.1 材料

细胞株Caco2采购自美国菌种保藏中心(ATCC), 胎牛血清采购自Gibco公司, 青霉素、链霉素采购自杭州民生药业有限公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 细胞培养在DMEM完全培养基中, 添加10%的胎牛血清(fatal bovine serum, FBS), 青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 µg/mL). 于37 ℃、50 mL/L CO₂培养箱中通气培养.

1.2.2 MTT测定DDP对Caco-2细胞增殖的影响: 按照试剂盒要求配置MTT溶液, 浓度为5 mg/mL. 每孔加入培养基终体积1/10 MTT溶液, 37 ℃细胞培养箱内孵育4 h. 终止培养, 小心吸去孔内培养液. 加入100 µL MTT显色液, 摇床低速震荡10 min. 在570 nm处测定吸光度(A)值. 细胞存活率 = (实验组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值).

1.2.3 流水细胞仪检测DDP对Caco-2细胞凋亡的影响: 取对数生长的Caco-2细胞1×10⁶置于培养皿中培养24 h, 贴壁后, 分别加入终浓度为(0.000, 0.125, 0.250, 2.000, 4.000 µg/mL)的DPP; 培养48 h后, 胰酶消化后, 离心后弃上清, 加缓冲液200 µL, 分出100 µL作为参照. 细胞凋亡的检测: 取出细胞, 倒去培养液, 胰酶适度消化细胞, 用培养液吹打, 1500 r/min, 离心6 min, 去上清. PBS洗1次后, 重悬于1×Binding Buffer中, 转移至流式管中. 加入FITC-Annexin V和PI, 轻柔弹起混匀, 室温(25 ℃)避光孵育15 min. 加400 µL 1×Binding Buffer至每管中, 混匀. 1 h内上机分析.

1.2.4 Western blot检测DDP对Caco-2细胞Bcl-2、Caspase3、Caspase9蛋白表达的影响: Western blot实验方法介绍如文献[5]所示: 通过破裂细胞, 获取细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳, 并与抗Bcl-2、Caspase3、Caspase9 (Millipore)孵育过夜, 然后洗涤, 再与二抗孵育1 h, 最后用检测蛋白含量.

统计学处理 采用SPSS17.0软件包进行统计学处理, 实验数据以mean±SD表示, 组间数据通过方差分析和相关性分析进行分析, 以P<0.05表示数据是否具有统计学意义.

2 结果

2.1 顺铂诱导结肠癌细胞Caco-2的细胞凋亡

利用MTT法测定不同浓度的DDP(0.000, 0.125, 0.250, 2.000, 4.000 µg/mL)作用结肠癌细胞Caco-2, 从图1可以看出, 顺铂对结肠癌细胞Caco-2生存率的抑制作用在相同作用时间, DPP对Caco-2细胞抑制作用具有剂量依赖性, 其中作用浓度为4.000、2.000 µg/mL具有最明显的抑制作用, 且差异具有统计学意义(P<0.05). 低剂量组及DMSO干预组细胞存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05).

图1 MTT检测不同浓度的DDP作用结肠癌细胞Caco-2的增殖情况. ^aP<0.05, ^bP<0.01 vs 阴性对照组. DDP: 顺铂.

2.2 DDP对Caco-2细胞凋亡的影响

为了进一步确认DDP诱导结肠癌细胞Caco-2凋亡的效果, 我们采用相差和荧光显微镜下观察, 流式细胞检测结果显示: DDP能诱导Caco-2细胞的凋亡, 其诱导凋亡的效果. 细胞凋亡流式检测结果说明, DPP处理过的细胞与对照细胞相比, 早期凋亡细胞显著增多, 而晚期凋亡细胞几乎没有变化(图2).

图2 流式细胞仪检测DDP对Caco-2细胞凋亡. A: 阴性对照组; B: DDP实验组. DDP: 顺铂.

2.3 凋亡相关通路蛋白Bcl-2、Caspase3、Caspase9蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示: Bcl-2蛋白在结肠癌Caco-2细胞中低表达, DDP干预Caco-2细胞72 h后, 与对照组比较, Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05). Caspase9、Caspase3在Caco-2细胞中低表达, DDP干预Caco-2细胞48、72 h后, 与对照组比较, Caspase9、Caspase3表达明显升高(P<0.01)(图3).

图3 凋亡相关通路蛋白Bcl-2、Caspase3、Caspase9蛋白表达的影响. A: Western blot检测; B: Bcl-2相对表达量; C: Caspase3相对表达量; D: Caspase9相对表达量. ^aP<0.05, ^bP<0.01 vs 阴性对照组.

3 讨论

Bcl-2蛋白质家族成员包括促凋亡蛋白(pro-apoptotic proteins), 如Bax, Bim, Bok, Bad等, 抗凋亡蛋白(anti-apoptotic proteins), 如Bcl-2, Bcl-xl, Bfl-1等[6]. 抗凋亡蛋白通常以膜蛋白的形式存在, 而促凋亡蛋白则广泛分布于细胞质. 当外界有刺激细胞凋亡相关的应激发生时, 促凋亡相关的蛋白成员发生构象上的变化, 并从胞质中游离到细胞器膜上, 与膜上的抗凋亡蛋白, 如Bcl-2家族相结合, 进而抑制抗凋亡相关蛋白的生物活性, 导致细胞凋亡的发生[7], Bcl-2是线粒体凋亡途径的重要因子, Bcl-2蛋白通过以与线粒体膜上抗凋亡相关的蛋白结合, 继而对细胞色素C释放进行抑制, 促使细胞抗凋亡的发生[8,9].

Caspases是富含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶, 同时具有特异酶切天冬氨酸位点, 是一类与细胞凋亡相关的蛋白酶家族. Caspases家族是一类在氨基酸序列、结构及酶的特性上具有相似性的蛋白总称, 一般情况下, 以无活性的酶原形式存在于胞质中, 根据其具体构象可以分为3部分, 即一大一小两个亚基及一个N端前域. Caspase是促使细胞凋亡的最终途径, 在介导细胞凋亡的过程中发挥极其关键的作用, 是多条凋亡通路的汇聚点, 是执行凋亡的最终途径, 此外, Caspase的另外一种行使功能的机制是通过相互激活完成自我活化, 一旦启动凋亡过程, 即表现出级联放大效应[10]. Caspase9位于级联反应上游, 是最重要的凋亡始动子之一, 在其他蛋白参与下发生自我激化并激活下游的Caspase因子, 如Caspase3, 然后引起级联放大效应, 从而导致细胞的凋亡. Caspase3是重要的凋亡效应子, 是凋亡的关键蛋白酶[11], Caspase3一旦被激活, 即发生下游的级联反应,使凋亡不可避免. 在正常生理条件下, Caspase3在胞质中以无活性的酶原形存在, 一旦细胞发生凋亡, Caspase3在可以再胞质中被多种蛋白水解酶作用并发生裂解[12-14]. Caspase3活化后对细胞裂解依赖于3种作用方式[15]: (1)凋亡抑制物的酶解失活; (2)细胞架蛋白的酶解失活; (3)DNA修复相关蛋白的酶解失活. 有研究表明, Bcl-2蛋白不仅可以与线粒体膜结合, 抑制细胞色素C释放, 从而阻止Caspase的活化发挥其抗凋亡的作用, 还可拮抗Caspases级联放大效应; Caspase活化后则可灭活Bcl-2, Bcl-2灭活后可促使细胞的功能和形态发生变化, 诱导凋亡.

本实验初步探讨不同浓度顺铂对激素非依赖性结肠癌Caco-2细胞系的体外抑制作用和观察Caco-2细胞中Bcl-2、Caspase9、Caspase3蛋白表达, 并分析细胞系的体外抑制作用和蛋白表达之间的关系, 为进一步研究提供实验依据.

评论

背景资料

结肠癌是一种常见的消化系恶性肿瘤, 严重威胁着人们的健康. 结肠癌可以通过手术予以切除治疗, 但治疗后多半会出现复发和转移, 因此寻求到有效的抗癌药物成为结肠癌治疗的关键问题之一.

同行评议者

白雪, 副主任医师, 中国人民解放军北京军区总医院普通外科

研发前沿

铂类药物是目前最有效的抗癌药物之一, 广泛应用于各种实体瘤的治疗. 铂类药物的细胞毒作用主要是铂类与核蛋白连接, 形成铂类药物与DNA链间或链内交联以及DNA-蛋白质交联损伤, DNA损伤信号可以通过促分裂原活化蛋白激酶、p53、p73 和Bcl-2等多种信号转导通路, 介导凋亡信号的激活, 最终引起细胞凋亡或细胞周期抑制.

创新盘点

本实验初步探讨不同浓度顺铂对激素非依赖性结肠癌Caco-2细胞系的体外抑制作用和观察Caco-2细胞中Bcl-2、Caspases9、Caspase3蛋白表达, 并分析细胞系的体外抑制作用和蛋白表达之间的关系, 尚属首次.

同行评价

本研究有一定的新颖性.

备注

编辑:郭鹏 电编:都珍珍

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