芍药苷通过调节Caspase3活性及核因子κB信号通路诱导HepG2肝癌细胞凋亡

摘要

目的: 探讨芍药苷(paeoniflorin)对HepG2肝癌细胞凋亡诱导作用, 并考察其作用机制.

方法: 用不同浓度芍药苷(0.5、1.0、2.0 mg/mL)对HepG2肝癌细胞进行给药, MTT法检测细胞活力, Annexin V-FITC流式细胞法检测细胞凋亡情况, 酶标法检测Caspase3活性, Western blot检测核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路相关蛋白表达.

结果: 与对照组比较, 0.5、1.0、2.0 mg/mL芍药苷能逐渐降低HepG2肝癌细胞活力, 且在48 h, 抑制率最高(P<0.05); 与对照组比较, 0.5、1.0、2.0 mg/mL芍药苷能逐渐促进HepG2肝癌细胞凋亡并提高Caspase3活性(P<0.05), 还能显著抑制IκBα磷酸化, 从而促进细胞凋亡; 并且1.0、2.0 mg/mL芍药苷能抑制细胞核内NF-κB p65磷酸化(P<0.05).

结论: PF可能通过激活Caspase3活性以及抑制NF-κB p65和pIκBα表达促进HepG2细胞凋亡.

关键词: 芍药苷; HepG2肝癌细胞; 凋亡; 核因子κB信号通路; 磷酸化

核心提示: 芍药苷可通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路, 来抑制胃癌细胞增殖, 且芍药苷具有抗肝癌作用; Caspase3及NF-κB活性促进细胞凋亡是治疗肿瘤的有效手段之一, 因此本文拟通过调节Caspase3活性及NF-κB信号通路来探讨芍药苷对肝癌细胞凋亡的抑制作用.

Paeoniflorin induces HepG2 cell apoptosis by regulating Caspase3 activation and nuclear factor kappa B signaling pathway

Chun-Yang Bai, Hong-Lei Wang

Chun-Yang Bai, Medical Service Division, Nanyang Second People's Hospital, Nanyang 473012, He'nan Province, China

Hong-Lei Wang, Department of Hepatobiliary Surgery, Nanyang Second People's Hospital, Nanyang 473012, He'nan Province, China

Correspondence to: Chun-Yang Bai, Attending Physician, Medical Service Division, Nanyang Second People's Hospital, 66 Jianshe East Road, Nanyang 473012, He'nan Province, China. baichunyangwei@yeah.net

Received: April 16, 2015
Revised: May 10, 2015
Accepted: June 25, 2015
Published online: August 8, 2015

Abstract

AIM: To explore the effect of paeoniflorin on apoptosis of HepG2 cells and the underlying mechanisms.

METHODS: HepG2 cells were treated with different concentrations of paeoniflorin (0.5, 1.0, and 2.0 mg/mL). The viability of cells was detected by MTT assay. Apoptotic cells were detected by Annexin V-FITC flow cytometry. Caspase3 activity was measured with a colorimetric assay kit. The expression of nuclear factor kappa-B (NF-κB) related proteins was detected by Western blot.

RESULTS: Compared with the control group, paeoniflorin at concentrations of 0.5, 1.0, and 2.0 mg/mL could reduce cell viability, and the inhibitory rate peaked at 48 h (P < 0.05). Compared with the control group, paeoniflorin at concentrations of 0.5, 1.0, and 2.0 mg/mL could promote cell apoptosis, increase Caspase3 activity, and suppress NF-κB p65 phosphorylation (P < 0.05). Paeoniflorin at concentrations of 1.0 and 2.0 mg/mL could suppress IκBα phosphorylation (P < 0.05).

CONCLUSION: Paeoniflorin induces apoptosis of HepG2 cells possibly via the NF-κB signal pathway.

Key Words: Paeoniflorin; HepG2 cells; Apoptosis; Nuclear factor kappa B signaling pathway; Phosphorylation

0 引言

肝癌是世界上常见恶性肿瘤之一, 目前其主要治疗手段为手术, 但术后复发、转移率高. 因此, 寻求有效治疗肝癌, 降低复发率的药物成为研究热点. 芍药苷(paeoniflorin, PF)是从毛茛科植物芍药(Paeonia Lactiflora Pall)中提取的有效单体成分, 具有抗各种肿瘤活性[1-4]. 已有报道[1]芍药苷可上调Bax、p53表达, 下调Bcl-2表达, 从而促进HepG2肝癌细胞凋亡, 但其具体机制还尚未可知. 并且芍药苷可通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)信号通路, 来抑制胃癌细胞增殖[4,5], 因此本课题在此基础上探讨芍药苷是否也是通过抑制NF-κB信号通路, 来诱导HepG2肝癌细胞凋亡.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2肝癌细胞, 购自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC), 细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中. 芍药苷购自中国药品生物制品检定所. 其余的材料包括: 四唑盐试剂(MTT)(Sigma公司); BCA法蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所); ECL超敏发光液(碧云天生物技术研究所); 小鼠p65抗体(碧云天生物技术研究所); β-actin(碧云天生物技术研究所); 兔核因子κB抑制因子α(nuclear factor of kappa B inhibitor alpha, IκBα)抗体(Epitmics公司); 兔抗pp65抗体(Epitmics公司); Caspase3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司); 胎牛血清(Gbico公司); DMEM培养基(Gbico公司); CO₂培养箱(Thermo Scientific公司); 超净工作台(Thermo Scientific公司); Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪(瑞士TECAN集团公司); ChemiDoc^TM XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司).

1.2 方法

1.2.1 MTT实验: 将80%左右融合的HepG2肝癌细胞消化, 细胞浓度调整为4×10³个细胞/mL, 接种, 37 ℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养24 h. 加入含PF[终浓度(0.5、1.0、2.0 mg/mL]DMEM培养基, 继续培养24、48、72 h, 加MTT(5 mg/mL)

20 μL, 培养4 h后, 弃上清, 加DMSO 150 μL, 10 min左右后, 570 nm处测定吸光度(A)值. 计算药物对细胞生长的抑制率.

1.2.2 Annexin V-FITC流式细胞法检测软骨细胞凋亡: 细胞培养同1.2.1, 培养48 h. 加入含PF[终浓度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)]DMEM培养基, 按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的方法, 用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化, PBS洗涤, 2000 r/min离心5 min, 收集细胞; 加入Binding Buffer 500 μL悬浮细胞, 随后加入Annexin V-FITC 5 μL混匀后, 加入PI 5 μL, 混匀, 于室温避光反应5-15 min, 在1 h内进行流式细胞仪检测.

1.2.3 Caspase3酶活性检测: 按照Caspase3酶活性检测试剂盒说明书进行操作, 收集细胞, 裂解, 加底物, 显色, 于405 nm处测定A值.

1.2.4 Western blot收集细胞: 加入RIPA裂解液, 收获蛋白. 根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定. 跑SDS凝胶电泳, 后湿法砖膜. 孵一抗过夜, 二抗1 h, 后在膜上滴加ECL曝光液, 在凝胶成像系统中曝光. 用"Quantity one"软件对各抗体条带灰度值进行统计.

统计学处理 采用SPSS17.0统计分析, 所有数据至少重复3次, 并用mean±SD表示, 两组之间差异显著性经t检验, 以P<0.05为差异具有显著性意义.

2 结果

2.1 芍药苷抑制HepG2肝癌细胞的增殖

如表1所示, 随着给药浓度的增加(0.5、1.0、2.0 mg/mL), 芍药苷对HepG2肝癌细胞抑制作用逐渐增强, 在2.0 mg/mL时抑制率最大(P<0.05); 随着24、48 h给药时间增加, 芍药苷对HepG2肝癌细胞抑制作用也逐渐增强, 其中48、72 h作用强度一致, 所以在后续实验中我们选取48 h作为给药浓度.

表1 芍药苷对HepG2肝癌细胞增殖抑制作用 (mean±SD, %).

分组	剂量(mg/mL)	抑制率
		24 h	48 h	72 h
对照组	0.0	0.1±0.02	3.0±0.3	3.1±0.5
芍药苷	0.5	3.5±0.08a	14.5±2.12a	14.3±2.47a
	1.0	6.5±0.15a	23.7±3.63b	23.8±3.82b
	2.0	10.7±1.19b	35.3±5.14b	35.2±4.31b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

2.2 芍药苷对HepG2肝癌细胞凋亡诱导作用

与对照组比较, 0.5、1.0、2.0 mg/mL都能显著促进HepG2肝癌细胞凋亡(图1).

图1 不同浓度芍药苷对HepG2肝癌细胞凋亡诱导作用. A: 对照组; B: 0.5 mg/mL; C: 1.0 mg/mL; D: 2.0 mg/mL.

2.3 芍药苷对HepG2肝癌细胞Caspase3活性的影响

如图2所示, 与对照组比较, 0.5、1.0、2.0 mg/mL芍药苷能提高HepG2肝癌细胞Caspase3活性, 并呈剂量依赖性, 具有统计学意义(P<0.01).

图2 芍药苷对HepG2肝癌细胞Caspase3活性的影响. 1: 对照组; 2: 0.5 mg/mL; 3: 1.0 mg/mL; 4: 2.0 mg/mL. ^bP<0.01 vs 对照组.

2.4 芍药苷对对HepG2肝癌细胞NF-κB通路的影响

如图3所示, 芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞细胞核NF-κB p65蛋白磷酸化, 并呈剂量依赖性, 具有统计学意义(P<0.05), 而对细胞核内p65表达无任何影响, 无统计学意义. 因此继续探讨NF-κB p65上游蛋白的影响, 结果发现芍药苷对芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞IκBα蛋白磷酸化, 并呈剂量依赖性, 具有统计学意义(P<0.05), 对IκBα自身表达无任何影响(图4).

图3 芍药苷对对HepG2肝癌细胞NF-κB p65磷酸化水平的影响. A: Western blot结果; B: NF-κB p65蛋白相对表达量. 1: 对照组; 2: 0.5 mg/mL; 3: 1.0 mg/mL; 4: 2.0 mg/mL. ^aP<0.05, ^bP<0.01 vs 对照组. NF-κB: 核因子κB.

图4 芍药苷对HepG2肝癌细胞IκBα磷酸化水平的影响. 1: 对照组; 2: 0.5 mg/mL; 3: 1.0 mg/mL; 4: 2.0 mg/mL. ^aP<0.05, ^bP<0.01 vs 对照组. IκBα: 核因子κB抑制因子α.

3 结论

肝癌是世界上常见恶性肿瘤之一, 其危害仅次于肺癌, 全球每年有约100万例死于肝癌, 其中50%在我国[5-7]. 目前其主要治疗手段为手术, 但即使获得手术切除机会, 其复发、转移率依然相当高. 因此, 寻求有效治疗肝癌, 降低复发率的药物成为研究热点. 而很多的抗肿瘤药物, 包括化疗药物、激素、生物制剂, 都能够引起肿瘤细胞发生凋亡. 凋亡对肿瘤的抑制起到重要作用, 并且抑制NF-κB活性促进细胞凋亡是治疗肿瘤的有效手段之一[8]. 芍药苷可通过抑制NF-κB信号通路, 来抑制胃癌细胞增殖[2,4], 所以本文拟尝试用不同浓度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)芍药苷对HepG2肝癌细胞进行给药, 结果表明随着给药浓度的增加, 芍药苷可以逐渐地降低细胞活力, 抑制肿瘤细胞的增殖, 在48 h时其抑制率就可达到最高点. 与芍药苷对其他肿瘤细胞抑制作用浓度有稍许差别[4,9], 这可能是各种肿瘤细胞抵抗外环境不同所造成的, 对各种药物敏感程度不一样所致的.

Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一, 他被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中, 在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式, 可对多种蛋白底物进行降解, 从而在细胞凋亡过程中起关键作用, 被认为是整个凋亡级联反应的一个关键调节点[10]. Caspase3在HepG2肝癌细胞中活性高于给药组[11-13], 在本研究中, 与对照组中对比, 芍药苷(0.5、1.0、2.0 mg/mL)剂量依赖性抑制Caspase3活性.

NF-κB是一类广泛存在于肿瘤细胞内的重要转录因子, 是多信号转导途径的汇聚点, 参与组织细胞的免疫调节、炎症反应、生长分化和凋亡等[14]. 未受刺激时与IκB结合, 当受到刺激时, IκB磷酸化, 释放NF-κB, 使之恢复转录活性并从细胞质转移到细胞核内, 调节相关基因的表达. NF-κB在肝癌[15]、胃癌[16]、乳腺癌[17]等肿瘤中都被激活, 过表达. 在原发性肝癌中NF-κB持续被激活, 与原发性肝癌肿瘤的发生发展及预后不良密切相关[18], NF-κB抑制剂PDTC可抑制NF-κB活性, 抑制肿瘤细胞增殖[19]. 朱开梅等[20]报道八角中莽草酸可通过抑制NF-κB p65活性, 从而抑制人肝癌HepG2细胞增殖. 本实验结果也表明芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化, 最终提高Caspase3活性, 诱导肿瘤细胞凋亡.

因此可以得出PF可能通过激活Caspase3活性以及抑制pp65和pIκBα表达促进HepG2细胞凋亡.

评论

背景资料

肝癌是世界上常见恶性肿瘤之一, 目前其主要治疗手段为手术, 但术后复发、转移率高. 而芍药苷(paeoniflorin, PF)是从毛茛科植物芍药(Paeonia Lactiflora Pall)中提取的有效单体成分, 具有抗各种肿瘤活性, 因此本文通过一定剂量芍药苷作用于肝癌细胞HepG2, 并探讨其机制.

同行评议者

李孟森, 教授, 海南医学院, 海南省肿瘤发生和干预重点实验室

相关报道

朱开梅等报道八角中莽草酸可通过抑制NF-κB p65活性, 从而抑制人肝癌HepG2细胞增殖. 本实验结果也表明芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞NF-κBp65, IκBα蛋白磷酸化, 最终提高Caspase3活性, 诱导肿瘤细胞凋亡.

创新盘点

芍药苷可通过激活Caspase3活性以及抑制pp65和pIκBα表达促进HepG2细胞凋亡.

同行评价

本文研究内容新颖, 有一定的参考价值.

备注

编辑: 郭鹏 电编:闫晋利

参考文献

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