基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2015-01-08; 23(1): 16-21
在线出版日期: 2015-01-08. doi: 10.11569/wcjd.v23.i1.16
GLP-1通过抑制肝L02细胞脂性凋亡的可能机制
王珣, 王明林, 鲁新耀, 张鹏, 于红刚, 胡义奎
王珣, 王明林, 鲁新耀, 张鹏, 武汉市武昌医院消化内科 湖北省武汉市 430063
于红刚, 武汉大学人民医院消化内科 湖北省武汉市 430060
胡义奎, 华中科技大学同济医学院附属普爱医院神经内科 湖北省武汉市 430034
王珣, 主治医师, 在职博士, 主要从事消化系统疾病的发病机制研究.
基金项目: 武汉市卫生局科研基金资助项目, No. WX1321.
作者贡献分布: 此课题由王珣、鲁新耀及张鹏设计; 动物模型制作和基因、蛋白检测分析由王明林与于红刚操作完成; 统计学分析由胡义奎完成; 论文写作由王珣完成.
通讯作者: 胡义奎, 主治医师, 430034, 湖北省武汉市硚口区解放大道50号古田三路, 华中科技大学同济医学院附属普爱医院神经内科. 1274965507@qq.com
电话: 027-68831695
收稿日期: 2014-07-31
修回日期: 2014-10-11
接受日期: 2014-11-12
在线出版日期: 2015-01-08

目的: 探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)对棕榈酸(palmitic acid, PA)诱导的肝L02细胞脂性凋亡的影响及可能机制.

方法: 不同浓度PA(0.125、0.250、0.500 mmol/L)分别干预肝L02细胞; 使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测其在12、24和48 h时的细胞增殖活性; 将肝L02细胞随机分为对照组(NC组)、PA干预组(PA组)、PA+SP 600125组(PASP组)及PA+GLP-1组(PAGLP组), 运用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL法)检测细胞凋亡; 免疫印迹(Western blot)法检测c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、c-Jun、p-JNK及p-c-Jun蛋白表达.

结果: 和对照组相比较, 经PA处理的肝L02细胞增殖活性降低(P<0.05), 而且呈剂量依懒性; 0.5 mmol/L PA干预24 h后, 肝L02细胞凋亡率增加28.4%±2.6%, Western blot结果显示: JNK、c-Jun磷酸化增多; 加用SP 600125或GLP-1后, 细胞凋亡率分别减少21.7%±2.9%和19.4%±2.7%, 差异具有统计学意义(P<0.05), PAGLP组p-JNK与p-c-Jun蛋白表达有所下降, 差异具有统计学意义(P<0.05).

结论: PA可诱导肝L02细胞脂性凋亡; 此过程可能和JNK通路相关; GLP-1可能是通过抑制JNK信号通路来抑制肝L02细胞的脂性凋亡.

关键词: 非酒精性脂肪性肝炎; 游离脂肪酸; L02细胞; c-Jun氨基末端激酶; 凋亡

核心提示: 我们发现, 棕榈酸(palmitic acid, PA)诱导L02细胞发生凋亡的过程中出现c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)活化, 当应用JNK抑制剂SP 600125抑制JNK通路后, L02凋亡率下降, 用胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)可明显降低经PA诱导的肝L02细胞凋亡率, 抑制了p-JNK和下游底物p-c-Jun表达水平, 提示GLP-1可拮抗PA诱导的肝L02细胞的脂性凋亡, 其过程可能是通过JNK信号通路实现. 为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis)防治药物的研制提供一定的实验基础.
引文著录: 王珣, 王明林, 鲁新耀, 张鹏, 于红刚, 胡义奎. GLP-1通过抑制肝L02细胞脂性凋亡的可能机制. 世界华人消化杂志 2015; 23(1): 16-21
Glucagon-like peptide-1 suppresses palmitic acid induced L02 cell apoptosis through JNK pathway
Xun Wang, Ming-Lin Wang, Xin-Yao Lu, Peng Zhang, Hong-Gang Yu, Yi-Kui Hu
Xun Wang, Ming-Lin Wang, Xin-Yao Lu, Peng Zhang, Department of Gastroenterology, Wuchang Hospital of Wuhan City, Wuhan 430063, Hubei Province, China
Hong-Gang Yu, Department of Gastroenterology, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Yi-Kui Hu, Department of Neurology, Puai Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430034, Hubei Province, China
Supported by: Wuhan Health Bureau Scientific Research Fund, No. WX1321.
Correspondence to: Yi-Kui Hu, Department of Neurology, Puai Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Gutiansan Road, 50 Jiefang Avenue, Qiaokou District, Wuhan 430034, Hubei Province, China. 1274965507@qq.com
Received: July 31, 2014
Revised: October 11, 2014
Accepted: November 12, 2014
Published online: January 8, 2015

AIM: To investigate the potential effects of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) on palmitic acid (PA) induced apoptosis of hepatic L02 cells and the underlying mechanism.

METHODS: L02 cells were stimulated with different levels (0.125, 0.250 and 0.500 mmol/L) of PA for different durations (12, 24 and 48 h) in the presence or absence of GLP-1. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay was used to analyze the inhibitory effects on growth of L02 cells, and terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) assay was used to observe the apoptotic rate of the cells. The expression of c-Jun N-terminal kinase (JNK), c-Jun, p-JNK and p-c-Jun proteins was detected by Western blot assay.

RESULTS: The growth of the L02 cells was significantly inhibited by PA in vitro, and PA induced the expression of p-JNK and p-c-Jun. GLP-1 suppressed the activation of JNK and c-Jun induced by PA.

CONCLUSION: PA can inhibit the proliferation of L02 cells and induce cell apoptosis. The JNK signaling pathway is probably involved in the mechanism of PA induced apoptosis.

Key Words: Non-alcoholic steatohepatitis; Palmitic acid; L02 cells; c-Jun N-terminal kinase; Apoptosis
0 引言

游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)是体内的脂质代谢物质, 研究显示: FFA是诱导非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的发生最主要外在因子[1,2], 机制可能是FFA诱导了肝细胞的脂性凋亡. 我们先前的研究显示c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路参与此过程[3]. 目前临床上NASH的防治主要是针对发病机制进行的, 但尚无公认有效的治疗药物. 胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)为胰岛素促泌剂, 有增加胰岛素敏感性及减轻体质量等作用[4]. 本文意在探索GLP-1对FFA诱导的肝L02细胞脂性凋亡的影响及可能机制, 为新药研究奠定基础.

1 材料和方法
1.1 材料

L02细胞系购自武汉大学细胞收藏中心. 培养细胞所用试剂、试剂盒购自北京中杉生物科技有限公司. 棕榈酸(palmitic acid, PA)、JNK抑制剂SP 600125及实验用GLP-1、Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、Western blot试剂盒及TUNEL试剂盒均购自瑞士Roche公司. JNK及β肌动蛋白(β-actin)多克隆一抗以及单克隆二抗均购自美国Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1 L02细胞培养: 用含20%的胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)完全培养基稀释细胞悬液, 并留取少量的L02细胞进行纯度及活力鉴定. 以1×105-1×106 mL的密度接种到50 mL塑料培养瓶中, 在温度为37 ℃、体积分数为5%的CO2, 95%潮湿空气的CO2恒温培养箱中进行细胞培养. 培养瓶内L02细胞24 h后第一次换新鲜的DMEM培养液, 以后每隔3 d换液1次, 将培养液换为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基, 经3-4 d的消化传代. 选择生长状态良好的L02细胞用于实验.

1.2.2 实验分组与处理: 分组: 将传代的L02细胞随机分为4组: 对照组(NC组)、PA干预组(PA组)、PA+SP 600125组(PASP组)及PA+GLP-1组(PAGLP组).

处理: NC组为空白对照; PA组(0.5 mmol/L的PA干预24 h); PASP组(25 μmol/L的SP 600125预孵育1 h, 再予0.5 mmol/L的PA+25 μmol/L的SP 600125干预24 h); PAGLP组(50 nmol/L的GLP-1预孵育24 h, 再予0.5 mmol/L的PA及50 nmol/L的GLP-1共孵育24 h).

1.2.3 CCK-8法检测L02细胞的增殖活性: 参照我们先前的研究方法[5]对L02细胞进行培养. NC组加入20 μL的完全培养基, 而非对照组加入20 μL不同浓度PA(浓度分别为0.125、0.250、0.500 mmol/L)干预12、24和48 h. 然后每组加入10 μL的CCK-8溶液, 继续孵育3 h.

1.2.4 TUNEL法检测L02细胞凋亡: 严格按照试剂盒操作说明对L02进行细胞凋亡的检测; 随机选取5个视野, 计数100个细胞核. 凋亡率(%) = 凋亡细胞数/细胞总数×100%.

1.2.5 Western blot半定量测定p-JNK、p-c-Jun蛋白水平: 方法参照文献[5]. 使用GEl-pro 4.0软件进行灰度值定量.

统计学处理 正态计量资料以mean±SD表示; 细胞增殖抑制率的比较采用重复测量数据的方差分析(ANOVA); 组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA); 两两比较采用SNK-q法; P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 PA抑制L02细胞增殖活性

假定NC组增殖活性100%. 与NC组比较, 随着PA干预浓度的升高及干预时间延长, 细胞增殖活性降低, 差异具有统计学意义(P<0.05)(图1).

图1
图1 PA对L02细胞增殖活性的影响. PA: 棕榈酸.
2.2 PA干预L02细胞凋亡

正常的L02细胞之间相互连接并见融合, 出现抱团. 然而经过PA干预24 h后, 可见细胞间连接减少, 并可见崩解现象. 当加入SP 600125或GLP-1后, 上述情况有所改善(图2).

图2
图2 PA干预24 h后L02细胞形态学及加入SP 600125或GLP-1后的变化(×100). A: 对照组; B: PA干预组; C: PA+SP 600125组; D: PA+GLP-1组. PA: 棕榈酸; GLP-1: 胰高血糖素样肽-1; SP 600125: JNK抑制剂SP 600125.
2.3 TUNEL法检测凋亡

棕色为凋亡细胞. PA组凋亡率为27.2%±2.1%, NC组为3.2%±0.4%, 差异有统计学意义(P<0.05). 加入SP 600125或GLP-1的干预组, L02细胞凋亡率分别为21.3%±2.6%及17.3%±2.8%, 较PA组减少, 差异有统计学意义(图3, 4).

图3
图3 各组细胞DAB染色结果. A: 对照组(×200); B: PA干预组(×200); C: PA+SP 600125组(×200); D: PA+GLP-1组(×400). PA: 棕榈酸; GLP-1: 胰高血糖素样肽-1; SP 600125: JNK抑制剂SP 600125.
图4
图4 各组凋亡率比较. NC: 对照组; PA: PA干预组; PASP: PA+SP 600125组; PAGLP: PA+GLP-1组. PA: 棕榈酸; GLP-1: 胰高血糖素样肽-1; SP 600125: JNK抑制剂SP 600125.
2.4 Western blot结果

各组JNK、c-Jun蛋白表达差异无统计学意义. 与对照组比较, PA干预后p-JNK与p-c-Jun表达均上升, 而应用SP 600125或GLP-1预处理后, 两蛋白表达下降, 差异有统计学意义(图5).

图5
图5 各组细胞JNK、c-Jun、p-JNK、p-c-Jun蛋白表达比较. A: 各组蛋白表达Western blot结果; B: 各组p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun的相对水平. 1: 对照组; 2: PA干预组; 3: PA+SP 600125组; 4: PA+GLP-1组. PA: 棕榈酸; GLP-1: 胰高血糖素样肽-1; SP 600125: JNK抑制剂SP 600125; JNK: c-Jun氨基末端激酶.
3 讨论

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一组临床病理综合征, 包括NASH和单纯性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL)[6-10]. NASH可进一步发展为终末期肝病甚至肝恶性病变[11-13]. 然而目前临床上有效的防治NASH的药物较少, 针对发病机制的药物研制显得尤其重要, 然而NASH的发病机制尚不明确. NASH发生发展过程中肝细胞凋亡越来越受到研究者的关注, 逐渐成为目前NASH发病机制研究的热点[14]. 本实验采用不同浓度的PA成功诱导了肝L02细胞的凋亡, 表明高游离脂肪酸水平是促进肝L02细胞发生凋亡的重要机制之一.

JNK是位于细胞质内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶. 研究发现, JNK参与某些神经退行性疾病(如帕金森病)、糖尿病、脂质代谢紊乱等疾病的发生[15-17]. 作用机制可能是JNK在一些外源性因子刺激作用下(如游离脂肪酸等), 通过使其第63、73位丝氨酸残基发生磷酸化而活化. 活化的JNK与c-Jun等蛋白的氨基末端区域结合, 使转录因子活性区域发生磷酸化, 从而对细胞凋亡、分化起到调控作用[18]. 我们发现, PA诱导L02细胞发生凋亡的过程中出现JNK活化, 当应用JNK抑制剂SP 600125抑制JNK通路后, L02凋亡率下降. 这一现象可能提示JNK通路参与了FFA诱导的肝细胞脂性凋亡, 和我们先前的研究[5]结论一致.

GLP-1是一种肠道分泌的、促胰岛素分泌激素, 其包含30个氨基酸. GLP-1及其类似物药物的应用使得2型糖尿病的治疗获得突破性进展. 他和其他降糖药物治疗糖尿病的本质区别在于不导致胰岛B细胞凋亡. NASH和糖尿病同属代谢综合征范畴, 他是代谢综合征的肝脏的一种表现形式. 目前临床有使用口服降糖药来治疗NASH[19], 作用机制多为降低胰岛素抵抗及调节脂质代谢, 但均无法解决NASH发展过程中肝细胞脂性凋亡这一难题.

本研究还发现加用GLP-1可明显降低经PA诱导的肝L02细胞凋亡率, 抑制了p-JNK和下游底物p-c-Jun表达水平, 提示GLP-1可拮抗PA诱导的肝L02细胞的脂性凋亡, 其过程可能是通过JNK信号通路实现. 为NASH防治药物的研制提供一定的实验基础.

评论
背景资料

目前临床上非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的防治主要是针对发病机制进行的, 但尚无公认有效的治疗药物. 胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)为胰岛素促泌剂, 增加胰岛素敏感性及减轻体质量等作用, 目前主要用于糖尿病等代谢性疾病; 而NASH和糖尿病同属代谢综合征, GLP-1是否对NASH有治疗作用值得研究, 而且该机制的阐明为该药运用于临床提供实验基础.

同行评议者

许戈良, 教授, 安徽省立医院

研发前沿

NASH可进一步发展为终末期肝病甚至肝恶性病变, 然而NASH的发病机制尚不明确. NASH发生发展过程中肝细胞凋亡越来越受到研究者的关注, 逐渐成为目前NASH发病机制研究的热点. 本实验采用不同浓度的棕榈酸(palmitic acid, PA)诱导肝L02细胞的凋亡, 探寻可能机制.

相关报道

目前临床有使用口服降糖药来治疗NASH, 作用机制多为降低胰岛素抵抗及调节脂质代谢, 但均无法解决NASH发展过程中肝细胞脂性凋亡这一难题. 本研究发现GLP-1可明显降低经PA诱导的肝L02细胞凋亡率, 其过程可能是通过JNK信号通路实现.

同行评价

本文的科学性、创新性及可读性能较好地反映我国胃肠病学临床和基础研究的先进水平.

编辑:韦元涛 电编:都珍珍

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