MicroRNA570通过Wnt/β-catenin通路抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖及调控机制

摘要

目的: 探讨microRNA570(miR-570)对人结肠癌细胞株HT-29生物学特性的影响, 并阐明其对Wnt/β-catenin通路的影响机制.

方法: 将miR-570 mimics转染人结肠癌细胞株HT-29后, 采用cell counting(CCK-8)法检测细胞增殖变化, 应用实时定量PCR技术检测转染后HT-29细胞中miR-570的表达, Western blot技术及实时定量PCR技术检测各组中胞核及胞浆内β-catenin的变化, 及对Wnt/β-catenin通路下游基因c-myc、cyclinD1和survivin表达的影响.

结果: HT-29细胞转染miR-570 mimics后, HT-29细胞增殖能力下降, 72 h细胞增殖抑制率最为明显, 约为53.23%±1.22%(P<0.05). 实时定量PCR结果显示miR-570表达上调20倍(20.01±0.32)(P<0.05). Western blot技术及实时定量PCR技术检测显示, β-catenin、c-myc、cyclinD1和survivin蛋白表达和mRNA表达均下降(P<0.05), 而空白对照组与阴性对照差异无统计学意义. Western blot结果进一步证实胞核内β-catenin的蛋白表达量下降明显, 而胞浆内, β-catenin的蛋白表达量无明显变化.

结论: miR-570能明显抑制人结肠癌细胞株HT-29的增殖, 并下调Wnt相关基因的表达, 其可能作为抑癌基因参与Wnt/β-catenin信号通路的调节.

关键词: MicroRNA570; HT-29; β-catenin; Wnt

核心提示: 结肠癌是危害人类健康的重大疾病之一, 在世界范围内是位居前列的常见肿瘤. Wnt/β-catenin信号通路的激活对结肠癌的发生、发展起重要作用. 而miR-570与Wnt/β-catenin信号通路的相关性文献鲜有报道. 本研究探讨上调miR-570后在结肠癌细胞株中的作用及其作用机制, 分析针对miR-570的靶向治疗对结肠癌的治疗价值.

MicroRNA570 inhibits human colon cancer HT-29 cell proliferation via Wnt/β-catenin pathway

Yu-Lan Ye, Chun-Li Zhou, Zhi Pang, Jia-Ju Zheng

Yu-Lan Ye, Chun-Li Zhou, Zhi Pang, Jia-Ju Zheng, Department of Gastroenterology, Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China

Supported by: Youth Foundation of Suzhou City, No. KJXW2012024

Correspondence to: Chun-Li Zhou, Chief Physician, Department of Gastroenterology, Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 242 Guangji Road, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China. pangzhi0273@sina.com

Received: February 26, 2014
Revised: April 6, 2014
Accepted: April 20, 2014
Published online: June 18, 2014

Abstract

AIM: To investigate the effect of microRNA570 (miR-570) on the proliferation and biological properties of HT-29 cells and the possible mechanisms involved.

METHODS: An miR-570 mimic was transfected into human colon cancer HT-29 cells. Cell proliferation was studied by cell counting kit-8 assay (CCK-8). Total miRNA was extracted and the relative expression of miR-570 was quantified by real-time quantitative PCR. Western blot and real-time quantitative PCR were performed to analyze the expression of β-catenin in the cytoplasm and nucleus. The expression of c-myc, cyclinD1 and survivin was also detected by real-time quantitative PCR and Western blot.

RESULTS: After transfection with the miR-570 mimic, the proliferation ability of HT-29 cells decreased. The inhibitory effect was most significant at 72 h (53.23% ± 1.22%) (P < 0.05). The expression of miR-570 was up-regulated more than 20 times (20.01 ± 0.32) (P < 0.05). The mRNA and protein expression of β-catenin, c-myc, cyclinD1 and survivin was decreased in the miR-570 mimic group, compared with blank and negative control groups. Western blot results further confirmed that the protein expression of β-catenin in the nucleus decreased significantly, although its expression in the cytoplasm did not change significantly.

CONCLUSION: MiR-570 significantly inhibits the proliferation of HT-29 cells possibly by regulation of the Wnt/β-catenin signal pathway.

Key Words: MicroRNA570; HT-29; β-catenin; Wnt

0 引言

结肠癌是消化系常见的恶性肿瘤之一, Wnt信号通路的激活对结肠癌的发生、发展起重要作用[1]. Wnt信号通路分为"经典Wnt信号通路"及"非经典Wnt信号通路", 其中非经典Wnt信号通路是研究最深入的一支, 又称为Wnt/β-catenin信号通路. 研究表明, 90%以上人类结肠癌存在Wnt/β-catenin信号通路的激活即细胞内β-catenin的积聚[2]. MicroRNA(miRNA)是一类长约21-25个核苷酸的小分子非编码RNA, 通过与靶RNA的3端非翻译区互补结合以降解靶RNA或阻遏其转录和翻译, 由此参与基因的转录后调控[3]. 有研究显示Wnt通路受到多种基因的共同调节, 并已发现部分miRNA作为癌基因或抑癌基因调节Wnt信号通路的活性.

我们的前期研究结果显示, 塞来昔布干预结肠癌细胞株HT-29后, 芯片筛选得到差异表达的miRNAs 28种[4]. 采用文献报道的靶基因与三个靶基因预测软件(miRNAs、RNAHybrid和Targetscan)预测差异表达miRNAs可能作用的靶基因; 并采用Enrichment分析和GenGO Pathway分析探讨了靶基因参与的特异性通路分类, 从而构建了靶基因与其调控miRNAs之间的通路关系. 我们的结果进一步显示, miR570参与的通路中可能性最大的为Wnt/β-catenin信号通路, 其可能的靶基因为CTNNB1(β-catenin)等. 本实验通过将miR-570 mimics瞬时转染人结肠癌HT-29细胞中, 分析结肠癌细胞的增殖活力、miR-570的表达及对Wnt信号通路下游靶基因的影响, 以此探讨miR-570对结肠癌细胞的作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM细胞培养基、OPTI-MEM细胞转染培养基和胎牛血清购自Gibco; 细胞转染试剂Lipofectamine^TM 2000、RNA抽提裂解液TRIzol和SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒均购自Invitrogen公司; β-catenin、c-myc、cyclinD1、survivin、miR-570和内参照的引物由上海吉码公司合成; 多克隆抗体购自CST公司; Western blot相关试剂、全细胞蛋白提取试剂盒、BCA法测蛋白浓度试剂盒、CCK-8试剂盒均购自上海碧云天生物公司; 人结肠癌HT-29细胞(购自苏州大学细胞生物学实验室)采用DMEM培养基和10%FBS培养.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 人结肠癌细胞HT-29在含10%胎牛血清的DMEM培养基中, 于37 ℃、5%的CO₂条件下培养, 每两天换液1次, 3-4 d传代1次. 细胞融合至80%时进行转染.

1.2.2 细胞转染: miR-570 mimics和阴性对照组(NC)序列由上海吉码公司设计并合成. 实验分为3组: (1)空白对照组(BC组): 给予常规培养液; (2)阴性对照组(NC组): 细胞转染随机合成的miR-570 mimics NC片段; (3)实验组(mimics组): 细胞转染miR-570 mimics组. miR-570 mimics序列为: 正义链: 5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3', 反义链: 5'-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3'. miR-570 mimics阴性对照为随机合成, 正义链: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', 反义链: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'. 具体方法参见Lipofectamine 2000操作手册. 取对数生长的细胞接种于六孔板, 细胞生长至占培养孔80%-85%时进行转染. 制备miRNA/LipofectamineTM 2000复合物如下: 稀释10 μL Lipofectamine^TM 2000至100 μL无血清培养液OPTI-MEM中; 同时用100 μL无血清培养液OPTI-MEM稀释miR-570 mimics和阴性对照; 将两种混合物轻轻混合均匀, 室温放置20 min后即得到miRNA/Lipofectamine^TM 2000复合物. 将miRNA/Lipofectamine^TM 2000复合物轻滴入6孔培养板中, 37 ℃培养箱培育18-24 h后, 每孔加入1800 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养细胞, 转染48 h后, 倒置荧光显微镜观察转染率, 转染率为80%, 取细胞进行实验.

1.2.3 细胞增殖抑制实验(CCK-8实验): 取对数生长的细胞按每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板, 每组细胞设3个平行孔. 培养24 h后进行转染, 转染后24、48、72 h, 加入浓度为10 μL的细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8 assay, CCK-8)溶液, 酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度(A)值. 细胞增殖抑制率 = 1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组平均A值-空白组A值)×100%. 实验重复3次.

1.2.4 Real-time PCR检测miR-570的表达量: miR-570 TRIzol一步法提取转染率达80%细胞总RNA, 分光光度计测定总RNA的纯度, 甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量. 应用miScript Reverse Transcription反转录试剂盒将其反转录为cDNA, 反应条件: 37 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min. 以cDNA为模板, 应用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR, 以U6为内参照, 各个miRNA和U6 snRNA的特异性引物根据miRNA的序列(http://microrna.sanger.ac.uk/)及U6 snRNA序列应用Primer Express software v2.0进行设计, 引物序列为分别为U6: TTCGTGAAGCGTTCCATATTT, miRNA570: TCTCCTCTGCTGGTCTCATAC, 实时荧光定量PCR检测在7300定量PCR仪上进行. PCR反应条件: 95 ℃预热20 min 94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s, 共40个循环. 以2-∆∆Ct表示每个miRNA的相对表达量, ∆Ct = CtmiRNA-CtU6. 实验重复3次.

1.2.5 Real-time PCR检测β-catenin, c-myc, cyclinD1, survivin mRNA表达量: 以cDNA为模板, 实时荧光定量PCR检测在7300定量PCR仪上进行, 采用管家基因GAPDH为内参照. 引物序列如下: β-catenin的上游引物为5'-GCCAGTGGATTCCGTACTGT-3', 下游引物为5'-GAGCTTGCTTTCCTGATTGC-3'; c-myc上游引物为5'-ATCACAGCCCTCACTCAC-3', 下游引物为5'-ACAGATTCCACAAGGTGC-3'; cyclinD1上游引物为5'-CCGTCCATGCGGAAGATC-3', 下游引物为5'-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3'; survivin的上游引物为5'-TCAGTGGGGCAGTGGATG-3', 下游引物为5'-CCTGGCAGCCTTTCTCA-3'; PCR反应条件: 95 ℃预热20 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 72 ℃ 15 s, 共40个循环. 实验重复3次.

1.2.6 免疫印迹实验(Western blot)检测β-catenin、c-myc、cyclinD1、survivin蛋白表达水平: 胞浆蛋白及胞核蛋白提取如下: 取培养细胞5×10⁶-1×10⁷个/mL, 离心, 收集细胞, 弃上清, 估计细胞压积(PCV), 每20 μL细胞压积中加入200 μL BufferA, 涡旋震荡, 冰浴, 加入11 μL BufferB, 继续震荡、冰浴, 离心(16000 g, 5 min), 收集上清即为胞浆蛋白. 在离心沉淀物中加入BufferC, 震荡、冰浴、离心, 再次取得上清即为核蛋(具体按照试剂盒说明书操作). 常规法提取细胞总蛋白. BCA法测定蛋白浓度. 样本加入10%SDS-PAGE电泳分离, 电转至纤维素膜上. 一抗浓度(b-catenin 1:1000, c-myc 1:1500, cyclinD1 1:2000, survivin 1:2000)室温孵育过夜, 洗膜3次. 二抗浓度为1:10000, 室温孵育2 h, 洗膜. 以β-actin为内参照. 实验重复3次.

统计学处理 数据应用SPSS12.0软件进行统计学分析, 计算数据以mean±SD表示, 两样本均属间比较采用独立分组t检验. 多组之间数据分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA). P<0.05差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-570对HT-29细胞增殖的影响

用CCK-8法分析转染24、48、72 h的细胞增殖活力, 测得mimics组与对照组相比, mimics组在转染miR-570后各时点的细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.01), 72 h的抑制作用最明显, 细胞增殖抑制率为53.23%±1.22%(表1).

表1 HT29细胞转染后各监测时点细胞增殖抑制率 (n = 3, mean±SD, %).

分组	24 h	48 h	72 h
BC组	16.63±2.4	15.62±0.28	18.53±1.56
NC组	15.98±0.45	17.45±0.95	19.21±1.42
mimics组	38.47±0.24bd	45.12±0.23bd	53.23±1.22bd

^bP<0.01 vs BC组;

^dP<0.01 vs NC组. BC组: 空白对照组, 给予常规培养液; NC组: 阴性对照组, 细胞转染随机合成的miR-570 mimics NC片段; mimics组: 实验组, 细胞转染miR-570 mimics组.

2.2 转染48 h后不同细胞组间miR-570的表达水平

与空白对照组(1.00±0.05)相比, miR-570 mimics组(20.01±0.32)表达上调20倍(P<0.05)(图1).

图1 HT-29细胞转染miR-570 mimics后对miR-570的表达影响. ^aP<0.05. BC组: 空白对照组, 给予常规培养液; NC组: 阴性对照组, 细胞转染随机合成的miR-570 mimics NC片段; mimics组: 实验组, 细胞转染miR-570 mimics组.

2.3 外源性miR-570对Wnt通路中β-catenin、 c-myc、cyclinD1、survivin的影响

2.3.1 对β-catenin的影响: β-catenin进入细胞核是Wnt信号通路关键调节步骤, 本实验运用实时定量PCR及Western blot检测miR-570 mimics转染HT-29细胞后β-catenin表达量的变化. 实时定量PCR结果显示, 与对照组相比, miR-570 mimics组β-catenin mRNA下调约36.5%(P<0.05). Western blot结果显示细胞浆内β-catenin表达量无明显增加, 但细胞核内β-catenin的表达量明显下调(图2).

图2 HT-29细胞转染miR-570 mimics后对β-catenin的影响. ^aP<0.05. A: HT-29细胞总β-catenin mRNA表达水平; B: 细胞浆及细胞核内β-catenin蛋白表达水平. BC组: 空白对照组, 给予常规培养液; NC组: 阴性对照组, 细胞转染随机合成的miR-570 mimics NC片段; mimics组: 实验组, 细胞转染miR-570 mimics组.

2.3.2 对c-myc、cyclinD1、survivin的表达影响: cmy-c、cyclinD1和survivin是Wnt通路的下游因子. 而本实验在转染miR-570 mimics后, cmy-c、cyclinD1和survivin mRNA表达受到抑制(P<0.05), Western blot结果与其相符, cmy-c、cyclinD1和survivin表达量下降, 空白对照组和阴性对照组差异无统计学意义(图3).

图3 HHT-29细胞转染miR-570 mimics后对c-myc、cyclinD1、survivin表达影响. ^aP<0.05. A: c-myc、cyclinD1、survivin mRNA表达水平; B: c-myc、cyclinD1、survivin蛋白表达水平. BC组: 空白对照组, 给予常规培养液; NC组: 阴性对照组, 细胞转染随机合成的miR-570 mimics NC片段; mimics组: 实验组, 细胞转染miR-570 mimics组.

3 讨论

miRNA是一类长约21-25个核苷酸的小分子非编码RNA, 广泛存在于动植物中. 大量研究表明, miRNA通过调控细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和血管生成等肿瘤相关基因的表达, 参与肿瘤的发生发展和预后.

结肠癌的发生发展是一个多因素参与多基因改变的病变过程, 具有复杂的分子机制, 深入了解结肠癌发病的分子机制对于结肠癌的治疗有重要意义. Wnt/β-catenin通路是Wnt通路中研究最为深入的一条分支. 他主要通过激活β-catenin在核内的功能来调节靶基因.

现有研究显示miR-570在人胃癌中低表达[5], 可能具有抑癌基因的作用. 而Wang等[6]的研究也显示miR-570靶定于B7-H1基因的功能区, 调节B7-H1分子的表达, 从而促进胃癌的进一步发展. 此外miR-570对CD274也有调控作用, 且呈剂量依赖性[7].

我们的前期工作发现塞来昔布能够诱导结肠癌细胞株HT-29中miR-570高表达, 推测其可能起到抑癌基因的作用, 而对该基因进行Enrichment分析及GeneGo Pathway分析推论, miR-570靶基因参与的通路中可能性最大的是经典Wnt通路, 即Wnt/β-catenin通路[4]. 为证实这一推测, 我们通过将miR-570 mimics转染至人结肠癌细胞株HT-29中后,行Real-time PCR显示miR-570表达升高20倍. CCK-8实验显示, miR-570瞬时转染后明显抑制HT-29细胞的增殖能力, 进一步证实miR-570具有抑癌基因的作用.

近年来的大量研究显示, miRNA与肿瘤的发生发展密切相关[8], miRNA既可作为抑癌基因下调原癌基因的活性, 也可作为癌基因下调抑癌基因的活性[9,10]. 而miRNA在肿瘤中的分子机制主要是对信号途径的调控.

为探讨miR-570是否通过Wnt/β-catenin通路发挥抑癌作用, 我们检测了miR-570 mimics转染后对Wnt通路中各因子的影响. 结果显示miR-570在HT-29细胞中的过表达可明显下调β-catenin、c-myc、cyclinD1、survivin. 已知β-catenin是Wnt信号通路的枢纽分子, 核内β-catenin高表达使癌细胞具备了上皮-间质转化和干细胞形成的能力[11,12]. 这两种能力可导致肿瘤干细胞播散, 进而引起肿瘤的侵袭与增殖. 而Su等[13]研究显示miR-200a主要通过调控β-catenin及下游因子的表达来抑制胃癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)能力, 从而调控WNT通路. c-myc、cyclinD1、survivin是Wnt/β-catenin通路的下游靶基因, 其中c-myc、cyclinD1是促进细胞增殖基因, survivin与抗细胞凋亡基因相关, 研究表明他们在结直肠中表达增高[14,15]. 而本实验表明, 外源性miR-570能促使HT-29细胞核内β-catenin表达降低, 同时使Wnt下游因子cmy-c、cyclinD1和survivin表达下调. 所以我们推测在结肠癌中miR-570通过Wnt/β-catenin信号通路影响结肠癌细胞的增殖.

总之, Wnt通路中的某个信号蛋白可受多个miRNA共同调节, 而某个miRNA可能同时调节Wnt通路中的多个信号蛋白分子, miRNA和Wnt信号途径的相互作用形成精密复杂的调控网络. 本实验通过细胞实验初步证miRNA570对HT-29细胞的抑制作用, 这有助于进一步了解结肠癌的发生发展机制, 为分子靶向治疗提供新的作用靶点.

评论

背景资料

结肠癌是消化系常见的恶性肿瘤之一, Wnt信号通路的激活对结肠癌的发生、发展起重要作用, 其中研究最深入的一支为Wnt/β-catenin信号通路. 而90%以上人结肠癌存在Wnt/β-catenin信号通路的激活即细胞内β-catenin的积聚.

同行评议者

卢晓梅, 教授, 研究员, 新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院

研发前沿

MicroRNA是一类长约21-25个核苷酸的小分子非编码RNA, Wnt通路受到多种基因的共同调节, 并已发现部分miRNA作为癌基因或抑癌基因调节Wnt信号通路的活性. 而我们的前期研究显示miR-570靶基因参与的通路中可能性最大的是Wnt/β-catenin通路.

相关报道

Li的研究显示, miR-570具有抑癌基因的作用, 他通过靶定B7-H1基因的功能区, 调节B7-H1分子的表达, 从而促进胃癌的进一步发展. 此外miR-570对CD274也有调控作用, 且呈剂量依赖性.

创新盘点

本研究结果显示, 通过上调miR-570的表达, 可以明显抑制结肠癌细胞的增殖,并导致Wnt通路相关因子β-catenin、c-myc、cyclinD1和survivin mRNA表达下降.

应用要点

本实验有助于进一步了解结肠癌的发生发展机制, miR-570是结肠癌中有意义的生物治疗靶点, 为分子靶向治疗提供了新的方向, 而其作用机制与Wnt/β-catenin通路有关.

同行评价

本文选题创新性较好, 作者以前期芯片数据的基础上做了更进一步的研究, 为结肠癌的发生发展提供了一定的理论基础, 有一定的科学意义.

备注

编辑:田滢 电编:鲁亚静

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