修回日期: 2013-05-12
接受日期: 2013-05-19
在线出版日期: 2013-06-28
目的: 检测微小RNA-130b(miR-130b)在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)组织中的表达并探讨其对ESCC细胞增殖、迁移的影响.
方法: microRNA(miRNA)芯片筛选ESCC组织中异常表达的miRNAs, TaqMan MGB探针法定量PCR检测19例ESCC组织及配对癌旁组织标本中miR-130b的表达; 通过脂质体转染模拟物miR-130b mimics(miR-130bm)促进ESCC细胞Eca109中miR-130b的表达, 转染抑制物miR-130b inhibitor(miR-130bi)抑制Eca109细胞中miR-130b的表达; 进一步采用CCK-8法和Transwell迁移实验检测ESCC细胞增殖、迁移的变化; 生物学信息预测miR-130b的靶基因, 双荧光素酶报告基因验证其靶向作用; 采用SYBR Green定量PCR和Western blot检测靶基因mRNA和蛋白表达.
结果: miR-130b在ESCC组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01); 转染miR-130bm可有效增加ESCC细胞Eca109中miR-130b的表达, 进而促进Eca109细胞的增殖和迁移, 平均迁移细胞数明显多于对照(112.9±2.4 vs 54.3±1.8, P<0.01); 转染miR-130bi则降低细胞中miR-130b的表达; 进而抑制细胞的增殖和迁移, 平均迁移细胞数较对照明显减少(33.9±2.3 vs 56.2±1.9, P<0.01). miR-130b可作用于PTEN3'非翻译区抑制其表达. miR-130b可负向调控PTEN蛋白表达, 并促进Akt磷酸化, 但对PTEN mRNA表达无明显影响.
结论: miR-130b在ESCC组织中表达上调, 增加其表达促进ESCC细胞Eca109增殖和迁移, 降低其表达则抑制Eca109细胞增殖和迁移; miR-130b可在转录后水平负向调控PTEN的表达并促进Akt磷酸化. 提示miR-130b有望成为ESCC治疗的新靶点.
核心提示: 本研究初步证实了miR-130b在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)组织中表达上调, 具有促进ESCC细胞Eca109增殖和迁移的作用, 且可在转录后水平靶向调控PTEN蛋白的表达并促进Akt磷酸化. 本实验为ESCC发病机制的研究提供了新靶点, 为miR-130b用于ESCC的靶向治疗提供了初步的理论依据.
引文著录: 郁婷婷, 李硕, 傅敏根, 曹日昇, 朱宏, 施瑞华. miR-130b在食管鳞癌中的表达及对食管鳞癌细胞增殖和迁移的影响. 世界华人消化杂志 2013; 21(18): 1685-1692
Revised: May 12, 2013
Accepted: May 19, 2013
Published online: June 28, 2013
AIM: To detect the expression of microRNA 130b (miR-130b) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and explore its effects on the proliferation and migration of ESCC cells in vitro.
METHODS: MicroRNA (miRNA) microarray was used to select dysregulated miRNAs in ESCC. The expression of miR-130b in ESCC tissue specimens and matched tumor-adjacent tissue specimens was detected by real-time PCR. After the ESCC cell line Eca109 was transfected with miR-130b mimic (miR-130bm) or miR-130b inhibitor (miR-130bi), cell proliferation and migration were determined by cell counting kit-8 (CCK-8) assay and transwell migration assay. The target genes of miR-130b were predicted by bioinformatics and verified by dual luciferase reporter gene assay. The mRNA and protein expression of target genes were detected by real-time PCR and Western blot.
RESULTS: The expression of miR-130b was higher in ESCC than in matched tumor-adjacent tissue (P < 0.01). The expression of miR-130b was effectively enhanced in Eca109 cells transfected with miR-130bm and down-regulated in those transfected with miR-130bi. Transfection with miR-130bm promoted the proliferation and migration of Eca109 cells, and the number of migrating cells was significantly more in miR-130bm-transfected cells than in controls (112.9 ± 2.4 vs 54.3 ± 1.8, P < 0.01). In contrast, transfection with miR-130bi suppressed cell proliferation and migration, and the average number of migrating cells was significantly less in miR-130bi-transfected cells than in controls (33.9 ± 2.3 vs 56.2 ± 1.9, P < 0.01). MiR-130b could interact with 3′-untranslated region of PTEN and down-regulate its expression. MiR-130b could negatively regulate the expression of PTEN protein and promote Akt phosphorylation, but had no effect on the expression of PTEN mRNA.
CONCLUSION: MiR-130b is overexpressed in ESCC. Overexpression of miR-130b promotes the proliferation and migration of Eca109 cells, and inhibition of miR-130b expression suppresses cellular proliferation and migration. MiR-130b can regulate the expression of PTEN at the translational level and promote Akt phosphorylation. MiR-130b may be a potential target for the therapy of ESCC.
- Citation: Yu TT, Li S, Fu MG, Cao RS, Zhu H, Shi RH. Expression of miR-130b in esophageal squamous cell carcinoma and effect of miR-130b transfection on cell proliferation and migration in an esophageal squamous cell carcinoma cell line. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2013; 21(18): 1685-1692
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v21/i18/1685.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v21.i18.1685
食管癌是世界范围内高发的恶性肿瘤, 5年生存率为15%-25%, 在我国组织学类型以鳞癌为主, 加强对食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)发病机制的研究能更好地指导临床诊断和治疗[1]. 研究发现超过50%的microRNAs(miRNAs)位于肿瘤相关的染色体区域或染色体脆性位点, 可调节30%-60%人类基因的表达, 参与增殖、迁移等多种细胞生物学功能的调控, 在肿瘤的发生发展中具有重要意义[2,3]. miR-130b是新近发现的一种miRNA, 已有相关报道其在子宫内膜癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤中表达上调[4-6]. 目前尚未关于miR-130b在ESCC中的表达及功能的研究报道. 本实验旨在检测ESCC组织中异常表达的miRNAs, 进一步研究miR-130b对ESCC细胞株Eca109生物学功能的影响及对相关基因的调节作用, 以期为ESCC的靶向治疗提供新的理论基础.
收集22例ESCC组织及22例配对癌旁组织(南京医科大学第一附属医院胸外科手术标本, 2011-09/2012-05), 患者均为Ⅰ-Ⅲ期原发性ESCC患者, 且术前未接受放、化疗, 所有组织标本均经病理学检查确认. ESCC细胞株Eca109购自中国科学院细胞库, RPMI 1640培养基、胎牛血清(南京凯基), TaqMan反转录试剂盒、TaqMan定量PCR试剂盒、SYBR Green定量PCR试剂盒、hsa-miR-130b、U6探针(Applied Biosystems), 转染物(上海吉玛, 表1), CCK-8试剂盒(碧云天), Transwell小室(Millipore), PTEN、Akt、pAkt抗体(cell signalling technology), GAPDH抗体(bioworld), 二抗(Santa Cruz), TRIzol、PTEN、GAPDH引物、报告基因质粒(Invitrogen, 表1), 双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910( Promega), 其他试剂(Sigma).
| 名称 | 引物序列 |
| 模拟物对照 | 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' |
| 模拟物miR-130bm | 5'-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3' |
| 抑制物对照 | 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3' |
| 抑制物miR-130bi | 5'-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3' |
| GAPDH | |
| 上游引物 | 5'-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3' |
| 下游引物 | 5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACG-3' |
| PTEN | |
| 上游引物 | 5'-TTTGAAGACCATAACCCACCAC-3' |
| 下游引物 | 5'-ATTACACCAGTTCGTCCCTTTC-3' |
1.2.1 miRNA芯片检测: 用Agilent人miRNA检测芯片(产品编号: G4870A)同时对3例ESCC组织及其配对癌旁组织进行检测, 筛选出ESCC组织中异常表达的miRNAs, 此项工作由北京博奥公司代理完成.
1.2.2 细胞转染: ESCC细胞株Eca109用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养. 取对数生长期的Eca109细胞接种于6孔板中, 用脂质体LipofectaminTM2000试剂按照说明书分别进行转染: (1)NC组: 模拟物对照; (2)miR-130bm组: 模拟物miR-130b mimics; (3)NCi组: 抑制物对照; (4)miR-130bi组: 抑制物miR-130b inhibitor. 前2组终浓度为100 nmol/L, 后2组为200 nmol/L. 转染后在培养箱中继续孵育5 h, 换成含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h, 收集各组细胞进行相关试验.
1.2.3 实时荧光定量PCR检测: 采用TaqMan MGB探针法定量PCR检测19例ESCC组织及配对癌旁组织和各转染组细胞中miR-130b的表达; 用SYBR Green定量PCR检测各转染组细胞中PTEN mRNA的表达. TRIzol法提取总RNA, 采用TaqMan反转录试剂盒合成cDNA, 反转录反应条件为: 16 ℃, 30 min; 42 ℃, 30 min; 85 ℃, 5 min; 4 ℃, ∞. 以合成的cDNA作为模板, U6(TaqMan)、GAPDH(SYBR Green)作为内参, 进一步进行PCR反应, 扩增条件如下: 50 ℃, 2 min, 95 ℃, 10 min, 1个循环; 95 ℃, 15 s, 60 ℃, 60 s, 40个循环. 结果以2-△△Ct值表示.
1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖能力: 将各转染组细胞按3000个/孔接种于96孔细胞培养板中, 每孔100 μL培养液, 分别于培养24、48、72、96 h按10 μL/孔加入CCK-8检测试剂, 在培养箱中继续孵育2 h, 450 nm测定吸光度(A)值, 绘制增殖曲线.
1.2.5 Transwell细胞迁移实验: 用不含血清的培养基饥饿细胞12 h同步化, 各转染组分别取200 μL细胞悬液(含1×105个细胞)加入底膜微孔直径为0.8 μm的Transwell小室底部, 在下室(24孔板底部)加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液, 常规培养24 h后, 75%乙醇固定、结晶紫染液染色, 显微镜观察拍照, 随机取5个视野, 计算平均迁移细胞数.
1.2.6 靶基因预测: 用6.2版本TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)两个常用的miRNA靶基因预测数据库搜索miR-130b的靶基因, 并整合分析生物学信息.
1.2.7 Western blot实验: 提取各组细胞总蛋白, 10%SDS-PAGE凝胶电泳, 恒压100 V电泳, 恒流300 mA转膜, 室温封闭, 一抗PTEN(1:1000)、Akt(1:1000)、pAkt(1:1000), 4 ℃孵育过夜, 二抗(1:5000)室温孵育, 曝光、显影.
1.2.8 双荧光素酶报告基因实验: 合成携带PTEN-3'非翻译区(3'UTR)目的片段的质粒pGL3-control-PTEN-3'UTR. 按1.0×104个/孔将Eca109细胞接种于24孔板, 每孔100 μL液体, 生长融合至80%左右, pGL3-control-PTEN-3'UTR质粒和内参pRL-TK质粒(按质量比1000:1), miR-130bm及NC分别共转染细胞, 每组设3个平行孔, 转染24 h后收集细胞, 用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测, 计算各组相对荧光素酶活性.
统计学处理 实验数据使用SPSS17.0进行统计分析, 数据以mean±SD表示, 采用配对t检验比较ESCC组织和癌旁组织中miR-130b表达的差异, 两组指标间比较采用LSD-t检验; P<0.05为有显著性差异.
miRNA芯片分析结果以t检验显示有显著统计学差异(P<0.05), 表达量变化>2.0作为筛选条件, 与癌旁组织相比, 共有51个miRNAs在ESCC组织中表达上调, 其中miR-130b上调5.18倍. 定量PCR进一步证实miR-130b在ESCC组织中表达上调, 其相对表达量为2.87±0.97(P<0.01, 图1). miR-130bm组细胞中miR-130b表达量较NC组明显升高; 130bi组较NCi组则明显下降(P<0.01).
CCK-8检测结果示NC组和miR-130bm组、NCi组和miR-130bi组A值分别在24 h处达同步化, 无统计学差异(表2). 在48、72、96 h各时间点, 转染miR-130b mimics均可促进Eca109细胞的增殖, 而转染miR-130b inhibitor则抑制Eca109细胞的增殖(P<0.05, 表2, 图2).
| 分组 | 24 h | 48 h | 72 h | 96 h |
| 模拟物对照组 | 0.287±0.003 | 0.486±0.004 | 0.723±0.057 | 1.049±0.064 |
| miR-130b模拟物组 | 0.293±0.003 | 0.601±0.008 | 0.932±0.056 | 1.263±0.015 |
| 抑制物对照组 | 0.249±0.009 | 0.499±0.010 | 0.738±0.033 | 1.026±0.010 |
| miR-130b抑制物组 | 0.246±0.005 | 0.383±0.014 | 0.627±0.007 | 0.841±0.023 |
Transwell检测结果示各转染组细胞在24 h后均能穿过滤过膜(图3); miR-130bm组平均迁移细胞数明显多于对照NC组(112.9±2.4 vs 54.3±1.8); miR-130bi组平均迁移细胞数则少于对照NCi组(33.9±2.3 vs 56.2±1.9); 差异均有统计学意义(P<0.01, 图3).
TargetScan和miRDB预测结果均显示PTEN可能为miR-130b靶基因之一, TargetScan提示miR-130b与PTEN mRNA 3'UTR碱基不完全互补配对. 双荧光素酶报告基因检测结果示miR-130bm组的相对荧光素酶活性较对照NC组下降达50%以上(P<0.05, 图4).
Western blot结果示miR-130bm组PTEN蛋白表达明显受抑制, 其相对表达量为0.63±0.01(P<0.05), 而miR-130bi组PTEN蛋白表达量增加, 其相对表达量为1.41±0.08(P<0.05, 图5); SYBR Green定量PCR结果示miR-130bm组和NC组、miR-130bi组和NCi组分别相比, PTEN mRNA表达均无统计学差异.
Western blot结果示转染miR-130b mimics促进Akt磷酸化, 其相对表达量为1.84±0.13(P<0.05), 转染miR-130b inhibitor则抑制Akt磷酸化, 其相对表达量为0.74±0.01(P<0.05, 图5); 而总Akt蛋白表达量变化无统计学差异.
ESCC的发生发展是一个多阶段、多因素相互作用的过程, 可能与原癌基因的激活、抑癌基因的失活、肿瘤转移抑制基因异常等有关[7,8], 但其发病机制仍未完全阐明. miRNA是1993年首次发现的一类非编码内源性小分子RNA[9], 研究表明在多种肿瘤中均存在miRNA的表达异常, 通过形成庞大的调控网络, 在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的调节作用[10,11]. 目前miRNA在ESCC方面的研究开展仍较少[12]. 本研究首先采用miRNA芯片分析技术筛选出在ESCC组织中表达异常的miRNA, 其中表达显著上调的miR-21、miR-223等在ESCC方面已有相关研究报道[13,14], 而表达上调5.18倍的miR-130b在ESCC中的表达及功能未有相关报道.
Wu等[15]报道ESCC组织中33个miRNAs表达上调, 40个表达下调, 与本研究miRNA芯片分析结果存在一定的差异. 由此考虑到miRNA芯片结果可能具有一定的假阳性, 本研究扩大组织样本量, 采用TaqMan实时荧光定量PCR进一步证实miR-130b在ESCC组织中的表达上调. 肿瘤细胞的异常增殖和迁移是肿瘤发生发展过程中的重要环节, 我们通过转染miR-130b mimics和miR-130b inhibitor研究miR-130b在ESCC细胞Eca109中表达升高和降低对细胞增殖和迁移的影响, 结果显示过表达miR-130b促进Eca109细胞的增殖和迁移, 抑制miR-130b的表达使Eca109细胞的增殖和迁移能力减弱, 提示miR-130b在ESCC中具有促癌倾向. 已有研究报道miR-130b在子宫内膜癌、肝癌、胃癌等肿瘤中表达上调, 可促进肿瘤细胞增殖、迁移侵袭和增加对化疗药物的耐药性[3-5]; 而在卵巢癌、甲状腺乳头状癌等肿瘤组织中表达下调, 与肿瘤的侵袭性及对化疗药物的敏感性呈负相关[16,17]. 总之, miR-130b在不同的肿瘤中存在表达差异, 可能与肿瘤的组织特异性有关. 目前普遍认为在肿瘤中表达上调的miRNA通过抑制抑癌基因或调控细胞分化、凋亡的相关基因促进肿瘤生长, 发挥促癌作用, 而低表达的miRNA则抑制促癌基因发挥抑癌作用[18], 对miR-130b靶基因的研究有助于进一步明确其在ESCC中的作用机制. 根据靶基因预测结果, 作为重要抑癌基因之一的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue, PTEN)引起了我们的注意.
PTEN是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因, 位于染色体10q23区域, 其结构和功能异常存在于人类多种恶性肿瘤中[19-22]. PTEN作为Akt重要的上游因子, 可使磷酸酰肌醇三磷酸(phosphatidyl-inositol 3,4,5 trisphosphate, PIP3)脱磷酸化, 减少PIP3在浆膜上的积聚, 进而抑制Akt家族蛋白的磷酸化, 阻碍下游通路的激活, 最终抑制肿瘤细胞增殖、迁移及血管生成等[23]. Chang等[24]采用免疫组织化学方法检测PTEN蛋白在64例ESCC组织和64例配对正常食管上皮组织中的表达, 结果显示PTEN蛋白在ESCC组织中的表达量显著低于正常食管上皮组织. 而后Zhou等[25]采用腺病毒转染技术, 通过体内外试验证实PTEN在ESCC中可抑制细胞增殖, 促进凋亡, 减缓肿瘤的生长, 发挥抑癌基因的作用. 研究表明PTEN在多种人类恶性肿瘤中均存在基因突变或缺失, 但在ESCC中的发生率较低, 仅表现为蛋白表达的普遍降低[26]. 由此推断, PTEN在ESCC中的表达可能存在其他调控机制. Meng等[27]在肝癌中首次证实miR-21可与PTEN mRNA 3'UTR直接结合, 靶向抑制PTEN促进肝癌细胞的增殖和迁移侵袭. 随后相继有研究发现miR-221/222, miR-22可靶向作用于PTEN激活Akt信号通路发挥促癌作用[28,29]. 近期研究发现miR-216a/217可靶向结合PTEN和SMAD7增加肝癌复发率及对化疗药物的耐药性[30]. 这些研究报道提示在某些特定的恶性肿瘤中, miRNA的表达异常参与了PTEN表达的调控. 因此, 我们选择PTEN作为研究miR-130b在ESCC中作用机制的靶点分子. 由于靶基因预测存在很高的假阳性率, 本研究采用双荧光素酶报告基因实验证实miR-130b可作用于PTEN mRNA的3'UTR调控其表达. 大量研究表明miRNA可与靶基因mRNA 3'UTR序列完全或不完全互补配对结合, 进而促进靶基因的mRNA降解或抑制其蛋白表达, 在转录或转录后水平调控靶基因的表达[31]. 本实验结果表明miR-130b在转录后水平调控PTEN的表达, 并促进Akt磷酸化，这一过程可能是miR-130b促进ESCC细胞增殖、迁移的作用机制之一.
总之, 本研究初步证实了miR-130b在ESCC组织中表达上调, 具有促进ESCC细胞Eca109增殖和迁移的作用; 且可在转录后水平靶向调控PTEN的表达并促进Akt磷酸化. 本实验为ESCC发病机制研究提供了新靶点, 为miR-130b用于ESCC的靶向治疗提供了初步的理论依据. 但miR-130b靶向抑制PTEN, 促进Akt磷酸化后具体激活的信号通路, 及其在ESCC病变进展过程中的作用, 有待进一步研究阐明.
食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)发病率高, 5年生存率低, 加强其发病机制的研究有助于指导诊断和治疗. miRNAs参与调控细胞各项生物学功能, 在多种肿瘤的发生发展中具有重要的意义.
唐世刚, 教授, 湖南省人民医院
微小RNA-130b(miR-130b)是新近发现的一种miRNA, 已有相关研究报道在子宫内膜癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤中表达上调, 目前尚未有miR-130b在ESCC中的表达及功能的相关研究报道.
Li等研究发现miR-130b在子宫内膜不典型增生组织中表达上调, 在子宫内膜癌组织中上调更明显; 体内外实验证实miR-130b可靶向作用于人类DICER基因(DICER1)促进子宫内膜癌的侵袭.
本研究采用miRNA芯片分析技术筛选出ESCC组织中异常表达的miRNAs, 选取miR-130b进一步研究, 通过上调和下调ESCC细胞中miR-130b的表达探讨其对细胞增殖和侵袭的影响及可能的作用机制.
本实验为ESCC发病机制研究提供了新靶点, 为miR-130b用于ESCC的靶向治疗提供了初步的理论依据.
本研究总体设计合理, 方法可靠, 结论可信, 有一定的实际指导意义.
编辑:田滢 电编:闫晋利
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