临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-07-18; 20(20): 1900-1905
在线出版日期: 2012-07-18. doi: 10.11569/wcjd.v20.i20.1900
WCX磁珠联合MALDI-TOF-MS技术在结直肠癌诊断中的应用
王秀丽, 高春芳, 范乃军
王秀丽, 高春芳, 范乃军, 中国人民解放军第150中心医院全军肛肠外科研究所 河南省洛阳市 471000
王秀丽, 副主任技师, 主要从事细胞分子生物学以及消化系肿瘤的早期诊断研究.
作者贡献分布: 王秀丽与范乃军对此文所作贡献均等; 此课题由高春芳设计; 研究过程和数据分析由王秀丽与范乃军完成; 本论文写作由王秀丽与范乃军完成.
通讯作者: 高春芳, 教授, 471000, 河南省洛阳市涧西区华夏西路2号, 中国人民解放军第150中心医院全军肛肠外科研究所. chunfanggao@126.com
电话: 0379-64169372
收稿日期: 2012-04-09
修回日期: 2012-05-11
接受日期: 2012-06-01
在线出版日期: 2012-07-18

目的: 比较结直肠癌与正常人血清蛋白质谱的变化, 筛选特异性蛋白标志物, 建立结直肠癌诊断分类树模型.

方法: 收集血清样本133例(其中结直肠癌67例, 正常人66例), 随机分为建模组和验证组. 运用弱阳离子纳米磁珠(magnetic bead-weak cation exchange, MB-WCX)联合基质辅助激光解吸离子飞行质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS), 建立结直肠癌与正常人血清蛋白质谱. 用Flex Analysis 2.4软件收集数据, 应用ClinproTools 2.2软件对建模组34例结直肠癌和33例正常人血清差异蛋白质谱进行定量分析, 应用Genetic Algorithm算法建立结直肠癌诊断模型, 应用所获取的诊断模型对验证组样本(33例结直肠癌和33例正常人)进行分类诊断, 以评价诊断模型的诊断价值.

结果: 通过比较分析结直肠癌与正常人血清蛋白质谱, 发现共有33个差异蛋白峰(P<0.05), 其中在结直肠癌中表达上调25个, 表达下调8个. 利用其中5个差异峰(Mr分别为759, 3 316, 4 645, 4 248, 2 645 Dr)建立诊断模型, 获得了94.12%(32/34)敏感性和96.97%(32/33)的特异性, 经独立样本双盲验证, 其灵敏度为93.94%(31/33), 特异度为96.97%(32/33).

结论: 基于磁珠分离和MALDI-TOF-MS技术能直接检测出结直肠癌患者血清差异表达蛋白, 建立的诊断模型具有较高的敏感性和特异性, 对提高结直肠癌的诊断具有一定的临床意义.

关键词: 结直肠癌; 蛋白组学; 纳米磁珠; 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术
引文著录: 王秀丽, 高春芳, 范乃军. WCX磁珠联合MALDI-TOF-MS技术在结直肠癌诊断中的应用. 世界华人消化杂志 2012; 20(20): 1900-1905
Diagnosis of colorectal cancer by MALDI-TOF-MS combined with WCX magnetic beads
Xiu-Li Wang, Chun-Fang Gao, Nai-Jun Fan
Xiu-Li Wang, Chun-Fang Gao, Nai-Jun Fan, Institute of Anal-Colorectal Surgery, the 150th Central Hospital of Chinese PLA, Luoyang 471000, Henan Province, China
Correspondence to: Chun-Fang Gao, Professor, Institute of Anal-Colorectal Surgery, the 150th Central Hospital of Chinese PLA, 2 Huaxia West Road, Jianxi District, Luoyang 471000, Henan Province, China. chunfanggao@126.com
Received: April 9, 2012
Revised: May 11, 2012
Accepted: June 1, 2012
Published online: July 18, 2012

AIM: To explore the difference in serum proteomic spectra between patients with colorectal cancer and healthy individuals, and to identify the specific protein biomarkers.

METHODS: Serum samples collected from 67 colorectal cancer patients and 66 healthy individuals were randomized into model construction group and validation group. Magnetic beads-based weak cation exchange (MB-WCX) kit and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were used to profile serum proteome. Flex analysis software was used to analyze protein peaks for significant difference. A diagnostic model was then built using ClinproTools2.2software and evaluated blindly for reliability.

RESULTS: Thirty-three differentially expressed proteins in serum were screened between colorectal cancer patients and healthy individuals, including 25 up-regulated proteins and 8 down-regulated ones. Five proteins (759, 3316, 4645, 4248, and 2645 Dr) were used for building a ClinProt model which was able to classify colorectal cancer patients and healthy individuals with a sensitivity of 94.12% (32/34) and a specificity of 96.97% (32/33). A double blind validation test showed that the ClinProt model yielded a sensitivity of 93.94 (31/33) and a specificity of 96.97% (32/33).

CONCLUSION: Combination of MALDI-TOF-MS with WCX kit allows to directly screen proteins differentially expressed in the serum of patients with colorectal cancer, and these proteins can be used to diagnose early-stage colorectal cancer.

Key Words: Colorectal cancer; Proteomics; Magnetic beads; Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
0 引言

结直肠癌是常见恶性肿瘤之一, 在北美、澳洲、西欧等地区高发[1]. 在我国, 随着人们生活水平的提高、饮食结构及生活方式的改变, 结直肠癌的发病率亦呈上升趋势, 与肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等各种恶性肿瘤一起, 成为中国人口的第2大死因[2]. 早期患者及时手术治疗后5年生存率可到90%以上, 但中晚期患者即使行以手术为主的综合治疗, 仍有半数以上患者死于局部复发或转移[3]. 目前, 结直肠癌诊断技术虽然大有提高, 但仍有半数以上患者在首次就诊时已属中晚期, 因此同其他恶性肿瘤一样, 早期诊断是提高患者生存率和生活质量的关键[4].

本研究利用弱阳离子纳米磁珠(magnetic bead-weak cation exchange, MB-WCX)联合基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术对结直肠癌患者与健康志愿者血清蛋白质谱的变化进行分析对比, 旨在发现可用于结直肠癌早期临床诊断的新方法, 以期提高早期诊断水平, 改善预后.

1 材料和方法
1.1 材料

本项目研究得到我院伦理委员会认证, 所纳入病例及健康志愿者知情同意后行标本采集和相关检查. 本组结直肠癌患者67例, 术后经病理诊断为结直肠腺癌, 其中TNMⅠ期17例, TNMⅡ期60例, 男女比例为2.2:1.0, 平均年龄56岁±4.7岁, 术前经B超等影像学检查, 除外肝转移. 同时, 收集健康志愿者血清66例, 男女比例、年龄等与结直肠癌组差异无统计学意义, 经结直肠镜、B超等除外肠道、肝脏占位性病变. 以上血清标本均由中国人民解放军150中心医院肛肠外科研究所及其门诊提供. 按照完全随机化的方法, 将结直肠癌患者与健康志愿者分为建模组与验证组, 其中, 建模组包括结直肠癌34例与健康志愿者33例, 验证组健康志愿者与结直肠癌各33例.

采集志愿者清晨空腹静脉全血5 mL(不加抗凝剂), 室温静置30 min后, 以2 000 r/min离心15 min, 将上层血清取出并分装, 冻存于-80 ℃冰箱. 实验时, 样品常温解冻, 待用. 结直肠癌患者于术前当日清晨采集. MALDI-TOF-MS(Autoflex-Ⅲ)、MB-WCX及其缓冲液体系、α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4- hydroxycinnamic acid, HCCA)和混合标肽均购自Bruker公司. 乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、SPA(Sinapinic acid)、尿素、DTT、CHAPS、Tris-HCl、NaAC等购自美国Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 WCX纯化多肽: (1)4 ℃冰箱取出磁珠试剂盒, 取出弱阳离子磁珠悬浮液一管, 手动上下摇动, 完全混匀磁珠悬浮液, 1 min; (2)取出10 μL磁珠结合缓冲液(BS)加入200 μL样品管中, 再加入10 μL磁珠及5 μL血清, 用加样枪上下吸打混匀, 避免产生气泡; (3)室温静置5 min, 将样品管放入磁珠分离器, 使磁珠贴壁1 min, 磁珠与悬浮液体分离, 用加样枪吸去悬浮液体; (4)加入100 μL磁珠清洗缓冲液(WS), 在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次, 使样品管在磁珠分离器上静置, 磁珠贴壁, 用加样枪吸去悬浮液体, 枪头应避免接触到磁珠, 避免吸走磁珠, 重复本步骤2次; (5)从磁珠分离器上取下样品管, 并向样品管中加入5 μL磁珠洗脱缓冲液(ES), 混匀贴壁的磁珠, 反复吸打10次, 将样品管放入磁珠分离器, 磁珠贴壁2 min, 磁珠与悬浮液体充分分离后, 将上清液移入干净的0.5 mL样品管(先在管内加入5 μL稳定缓冲液(SS), 用加样枪小心吸打混匀); (6)先点1 μL洗脱样品, 室温放干后, 再点1 μL基质(3 g/L CHCA, 50% ACN, 2% TFA), 室温放干, 准备质谱分析.

1.2.2 质谱检测与数据采集: 采用Autoflex-Ⅲ MALDI-TOF-MS仪器, 应用线性模式, 采集范围为相对分子量范围600-18 000. 应用Flex Analysis 2.4软件收集数据, ClinproTools 2.2软件进行分析, 包括质谱图的平滑、衰减及标峰处理, 并输出含有质荷比值和峰强度的Excel格式数据, 软件自动对数据进行统计学处理, 以P<0.05为差异有统计学意义. ClinproTools 2.2分析建模组样本质谱图, 采用Genetic Algorithm算法建立诊断模板, 计算灵敏度与特异度. 用诊断模板对验证组样本进行分组, 以评价诊断模板的诊断价值.

2 结果
2.1 差异蛋白质定量分析

建立建模组样本(结直肠癌34例, 正常人33例)血清蛋白质谱, 在分子质量600-18 000范围内共检测到70个蛋白峰, 代表性蛋白质谱见图1. 比较分析结直肠癌与健康志愿者之间差异蛋白质谱, 共发现33个蛋白峰有显著性差异(P<0.05). 其中在结直肠癌中表达上调峰25个, 表达下调峰8个(表1). 从图2可见, 以m/z 759, 3 316, 4 645, 4 248和2 645 5个差异蛋白峰为例, 这5个质谱峰分别呈明显上调和下调趋势.

图1
图1 结直肠癌与健康志愿者代表性蛋白质谱. 其中红色代表结直肠癌, 蓝色代表健康志愿者.
图2
图2 质荷比为758、2645、3316、4248及4645 5个蛋白在结直肠癌中表达变化. 红色代表结直肠癌, 蓝色代表健康志愿者.
2.2 诊断模板的建立

利用ClinproTools 2.2中Genetic Algorithm算法建立了由上述5个差异表达蛋白(Mr分别为759, 3 316, 4 645, 4 248, 2 645 Dr)组成的诊断模型, 获得了94.12%(32/34)敏感性和96.97%(32/33)的特异性.

2.3 诊断模板的评价

为进一步评价本研究中所建立诊断模板的诊断价值, 我们将利用诊断模板对验证组样本进行双盲验证, 结果显示其灵敏度为93.94%(31/33), 特异度为96.97%(32/33), 约登指数为0.91.

3 讨论

结直肠癌为常见的恶性肿瘤之一, 据统计我国结直肠癌发病率有升高趋势, 严重威胁着人们的身心健康. 患者如获得早期诊断和治疗, 5年生存率将达到90%[5]. 遗憾的是, 大部分患者在确诊时已处于进展期或已有转移, 错过了极佳的治疗窗口期. 其原因是无特异性高的早期诊断方法, 因此从血清中寻求特异生物标志物用于结直肠癌的诊断是临床急需解决的难题. 结直肠癌早期诊断方法如直肠指诊、粪潜血试验、肠黏膜脱落细胞学检查及影像学检查等均不同程度地存在敏感性与特异性不高的问题, 而合适的肿瘤标志物将有利于癌症的检出. 目前临床应用最为广泛的结直肠癌相关性肿瘤标志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA), 敏感性为60.27%, 特异性仅为23.2%, 其敏感性与特异性较低, 临床应用价值有限, 目前血清CEA只是对结直肠癌的复发及转移有重要意义[6].

蛋白质组最早由澳大利亚Wiliams和Wilkins于1994年提出, 指的是"一个细胞或组织所表达的全部蛋白质". 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象, 从整体水平分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态, 以及蛋白质之间的相互作用与联系, 揭示蛋白质功能, 从蛋白质水平进一步认识生命活动的机理和疾病发生机制[7-10]. 由于SELDI-TOF-MS技术本身具有较强的操作依赖性, 实验结果可因样品来源和处理条件的不一致或操作过程的非标准化, 造成实验结果批次之间或同类样本在不同检测单位之间的平行性与可重复性较差, 使实验结果的可信度遭到质疑[11]. MALDI-TOF-MS是目前蛋白质组学研究的核心技术, 具有高灵敏度、高通量、重复性好等优点, 纳米磁珠可以根据蛋白质组分的理化性质不同对蛋白质进行分离提纯, 具有较好的重复性, 两者结合为疾病蛋白组研究提供了有力的工具, 目前已用于食管癌、肾移植、风湿类疾病、酒精中毒及乳腺癌等标志物的研究[12-17].

本研究采用纳米磁珠联合MALDI-TOF-MS技术对34例结直肠癌患者和33例健康志愿者进行了血清蛋白质谱对比分析研究, 结果发现有70个蛋白质峰具有判断性差别, 其中32个蛋白质峰具有显著性差异(P<0.05). 将两组血清蛋白质谱建立数据库, 利用ClinproTools统计软件对数据库进行分析, 确立了以m/z为759, 3 316, 4 645, 4 248和2 645等5个蛋白质所组成的模板, 能正确地将结直肠癌患者与正常人分组, 正确分组率达97%. 为进一步评价诊断模板的诊断价值, 我们将收集的另外一组样本作为验证组, 由建立的诊断模板对验证组样本在双盲的条件下进行分类, 结果显示, 该模板可以将33例结直肠癌中的31例正确分组, 33例正常人中的32例进行正确分组, 其灵敏度和特异度分别为93.94%(31/33)和96.97%(32/33), 约登指数为0.91, 具有较高的诊断价值.

总之, 我们采用WCX磁珠结合MALDI质谱对结直肠癌血清蛋白质谱进行了研究, 发现了一组差异蛋白质, 并建立了具有较高灵敏度和特异度的诊断模板. 所发现的差异蛋白为结直肠癌发生、发展研究提供了新的线索, 所建立的诊断模板为结直肠癌的诊断提供了新的有效方法, 对提高诊断水平具有重要意义.

评论
背景资料

结直肠癌的诊断及治疗发生了很大改进, 但其发病率和死亡率并未发生根本的变化, 主要原因在于缺乏高灵敏度、特异度的早期诊断方法. 蛋白质组学具有高通量、高灵敏度等技术优势, 为肿瘤早期诊断的研究开拓了新的视野.

同行评议者

何敏, 教授, 广西医科大学医学科学实验中心

研发前沿

应用磁珠分离结合MALDI-TOF-MS检测进行比较蛋白质组学研究, 可以发现差异蛋白, 通过软件分析, 建立诊断模板, 对疾病的筛查有重要价值, 是疾病蛋白质组学研究的热点, 但由于所发现的有诊断价值的多肽多是低丰度、小分子量蛋白, 其鉴定是一项具有挑战性的工作.

相关报道

磁珠结合MALDI-TOF-MS技术已应用于食管癌、乳腺癌、类风湿等疾病诊断研究, 通过软件分析, 建立了具有较高诊断价值的诊断模型.

创新盘点

利用磁珠结合MALDI-TOF-MS技术进行结直肠癌的比较蛋白质组学研究, 发现了多个有意义的蛋白, 通过软件分析建立了诊断模板, 通过双盲验证, 评价了诊断模型的临床应用价值.

应用要点

磁珠结合MALDI-TOF-MS技术可用于结直肠癌的初步筛查, 为血清标志物的发现提供了目标蛋白.

名词解释

MALDI-TOF-MS: 激光解析离子化飞行时间质谱与蛋白质分离纯化技术(磁珠)相结合, 经配套软件对结果定量分析, 发现疾病差异蛋白, 建立诊断模板, 并可利用此模板对疾病进行筛查诊断, 具有高通量、高灵敏度等技术优势.

同行评价

本研究利用磁珠结合MALDI-TOF-MS技术发现了一些有意义的蛋白, 对临床上结直肠癌的诊断和治疗提供了一定的参考价值.

编辑:张姗姗 电编:闫晋利

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