CRF通过CRF2受体介导肠上皮细胞中TLR4的表达

摘要

目的: 研究促肾上腺皮质释放因子(CRF)介导肠上皮细胞中Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)的表达, 并探讨其可能通过的受体途径.

方法: 常规培养人结肠上皮细胞株HT-29细胞, 将HT-29细胞分为正常对照组(不加刺激剂), 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激组(LPS 20 μg/L刺激24 h), 促肾上腺皮质释放因子(corticotrophin-releasing factor, CRF)刺激组(CRF 20 μg/L刺激24 h), CRF+LPS刺激组(预先CRF 20 μg/L刺激12 h, 更换细胞液后再与LPS 20 μg/L刺激12 h), CRF+Antalarmin组(CRF与Antalarmin 20 μg/L共刺激24 h), CRF+LPS+Antalarmin组(CRF与Antalarmin 20 μg/L共刺激12 h后再以LPS刺激12 h), CRF+Astressin2B组(CRF与Astressin2B 20 μg/L共刺激24 h), CRF+LPS+Astressin2B组(CRF与Astressin2B 20 μg/L共刺激12 h后再以LPS刺激12 h). 刺激结束后, 收取各组HT-29细胞, RT-PCR法和免疫印迹法检测各组上皮细胞中TLR4 mRNA和蛋白的表达. ELISA法检测各组细胞上清液中IL-8的表达.

结果: CRF可以诱导人结肠上皮细胞株HT-29细胞中TLR4表达导致IL-8分泌增多(P<0.05), CRF1受体拮抗剂不能有效地阻滞CRF对TLR4的诱导(P>0.05, CRF+LPS组 vs CRF组), CRF2受体拮抗剂可阻滞CRF对TLR4的诱导(P<0.05, CRF+LPS组 vs CRF组).

结论: CRF通过CRF2受体通路介导肠上皮细胞中TLR4的表达.

关键词: 促肾上腺皮质释放因子; Toll样受体; 肠上皮细胞

Activation of TLR4 by CRF in human intestinal epithelial cells is mediated by the CRF2 receptor

Li Yang, Peng-Yuan Zheng, Zhi-Qiang Liu

Li Yang, Peng-Yuan Zheng, Zhi-Qiang Liu, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Institute of Medical Microecology, Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, Henan Province, China

Supported by: the Preliminary Special Research Project of 973 Program, No. 2011CB512006.

Correspondence to: Peng-Yuan Zheng, Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Institute of Medical Microecology, 2 Jingba Road, Zhengzhou 450014, Henan Province, China. medp7l23@126.com

Received: February 18, 2012
Revised: March 24, 2012
Accepted: April 19, 2012
Published online: July 8, 2012

Abstract

AIM: To investigate the effect of corticotrophin-releasing factor (CRF) on the expression of toll-like receptor 4 (TLR4) in human intestinal epithelial cell line HT-29.

METHODS: HT-29 cells were divided into eight groups: non-treated group, LPS group (treated with 20 μg/L LPS for 24 h), CRF group (treated with 20 μg/L CRF for 24 h), LPS plus CRF group (pretreated with 20 μg/L CRF for 12 h and then treated with 20 μg/L LPS for 12 h), astressin 2B plus CRF group (pretreated with 20 μg/L astressin 2B for 12 h and then treated with 20 μg/L CRF), antalarmin plus CRF group (pretreated with 20 μg/L antalarmin for 12 h and then treated with 20 μg/L CRF), astressin 2B plus LPS group (pretreated with 20 μg/L astressin 2B for 12 h and then treated with 20 μg/L LPS), and antalarmin plus LPS group (pretreated with 20 μg/L antalarmin for 12 h and then treated with 20 μg/L LPS). The expression of TLR4 mRNA and protein was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting, respectively. The secretion of interleukin-8 in the culture supernatants was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

RESULTS: CRF could induce the expression of TLR4 in HT-29 cells and result in increased interleukin-8 secretion (P < 0.05). CRFR2 antagonist astressin 2B inhibited the expression of LR4 (P < 0.05, CRF+LPS group vs CRF group), while CRF1 antagonist antalarmin had no significant effect on the expression of TLR4 (P > 0.05, CRF+LPS group vs CRF group).

CONCLUSION: The induction of TLR4 expression by CRF in human intestinal epithelial cells is mediated by the CRF2 receptor.

Key Words: Corticotrophin-releasing factor; Toll-like receptor; Intestinal epithelial cells

0 引言

大量研究发现精神心理压力不仅可以诱发和/或加剧炎症性肠病症状[1], 还可以促进实验性结肠炎的产生[2], 促肾上腺皮质释放因子(corticotrophin-releasing factor, CRF)是一个重要的应激效应因子, 下丘脑中枢中的CRF通过诱导乙酰胆碱(acetylcholine, ACTH)促进糖皮质激素生成限制炎症介质的释放, 进而限制炎症反应, 而周围组织中的CRF则由免疫细胞、神经纤维等其他细胞释放局部发挥着促炎作用[3]. 周围型的CRF已不局限于应激因子, 更多的是一种促炎因子, CRF通过与其不同受体(CRF-R1或CRF-R2)结合而发挥不同生物学效应. 胃肠道中普遍存在着CRF-R1和CRF-R2, 溃疡性结肠炎组织中亦发现CRF的表达增高[4,5], 但增高的CRF是如何导致肠黏膜炎症并不清楚, 有研究显示CRF可诱导巨噬细胞中TLR4表达[6], 而Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)在肠黏膜上皮组织中的先天性免疫调节中发挥着重要作用[7], 与炎症性肠病肠黏膜炎症的发生密切相关, 本实验通过CRF及脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)以及CRF-R1受体拮抗剂Antalarmin和CRF-R2受体拮抗剂Astressin2B干预刺激结肠上皮细胞系HT-29细胞, 观察各组上皮细胞中TLR4的表达情况, 探讨CRF在肠上皮细胞中对TLR4的影响及可能通过的受体途径.

1 材料和方法

1.1 材料

HT-29细胞株购自中国科学院细胞库, CRF购自Sigma公司; LPS购自Sigma公司; 兔抗人Toll4受体多克隆抗体购自Santa Cruz公司; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG, 兔抗人β-actin单克隆抗体, 化学发光试剂盒, RPMI 1640培养液等.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 结肠癌上皮细胞株HT-29细胞复苏后, 接种培养于含100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素、链霉素的RPMI 1640培养基中, 置于37 ℃、50 mL/L CO₂孵箱中培养, 每天更换培养液, 4-5 d后以0.25%的胰酶消化传代. 取对数生长期细胞, 以5×10⁵的密度接种于50 mL培养瓶, 细胞生长至5×10⁶后, 换不含小牛血清的RPMI 1640培养液. 实验共分8组, 正常对照组(不加刺激剂), LPS刺激组(LPS 20 μg/L刺激24 h), CRF刺激组(CRF 20 μg/L刺激24 h), CRF+LPS刺激组(预先CRF 20 μg/L刺激12 h, 更换细胞液后再与LPS 20 μg/L刺激12 h), CRF+Antalarmin组(CRF与Antalarmin 20 μg/L共刺激24 h), CRF+LPS+Antalarmin组(CRF与Antalarmin 20 μg/L共刺激12 h后再以LPS刺激12 h), CRF+Astressin2B组(CRF与Astressin2B 20 μg/L共刺激24 h), CRF+LPS+Astressin2B组(CRF与Astressin2B 20 μg/L共刺激12 h后再以LPS刺激12 h). 刺激结束后, 收取各组HT-29细胞, PBS洗涤2次, 分别用来提取RNA, RT-PCR法检测各组TLR4受体mRNA; 提取总蛋白, 免疫印迹法检测各组TLR4蛋白量.

1.2.2 RT-PCR法检测HT-29细胞TLR4 mRNA的表达: 按照Triregent产品说明书提取RNA, 设计并合成人TLR4和人GAPDH(内参照)引物(表1). RT-PCR反应按照试剂盒说明书进行, 94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 58 ℃(内参58 ℃)退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃补延伸6 min. 阴性对照用RNase-free Water代替cDNA进行反应, 琼脂糖凝胶电泳、凝胶图像系统处理分析测定.

表1 引物序列.

引物名称	引物序列(5'-3')	引物大小(bp)
TLR4
sense	TGGATACGTTTCCTTATAAG	507
Anti-asense	GAAATGGAGGCACCCCTTC
GAPDH
sense	GCACCGTCAAGGCTGAGAAC	138
Anti-asense	TGGTGAAGACGCCAGTGGA

1.2.3 免疫印迹法检测各组HT-29细胞TLR4蛋白的表达: 将刺激后的各组HT29细胞, 分别加入细胞蛋白裂解液提取蛋白, Bradford方法测定蛋白浓度, 配置8%的SDS-PAGE凝胶, 将总蛋白加样, 恒压电泳, 恒流转膜, 加入5%的脱脂奶粉封闭过夜, 加一抗兔抗人Toll4受体多克隆抗体, 孵育2 h, PBS洗涤2次, 加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG, 孵育2 h, ECL显色, 暗室曝光. 凝胶图像分析.

1.2.4 ELSIA法检测IL-8: 取各组细胞上清液, 按照说明书进行检测.

统计学处理 所有数据计量资料用mean±SD表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 采用SPSS13.0软件做统计学分析, P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 CRF对HT-29细胞中TLR4表达的影响

LPS刺激组TLR4 mRNA(0.31±0.04 vs 0.28±0.02)和蛋白表达水平(0.48±0.17 vs 0.45±0.12)与对照组相比较, 差异无统计学意义(P>0.05); CRF组TLR4 mRNA(1.05±0.06 vs 0.28±0.02)和蛋白表达水平(1.08±0.21 vs 0.45±0.12)与对照组相比较, 差异有统计学意义(P<0.05), 而CRF+LPS组则更高于CRF组(1.68±0.05 vs 1.05±0.06, 1.81±0.18 vs 1.08±0.21), 两组之间差异有统计学意义(P<0.05, 图1, 2). 进一步检测各组细胞中IL-8水平, 发现与TLR4活化一致, 也相应增高(图3).

图1 各组HT-29细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达及CRF1受体拮抗剂干预结果. A: TLR4 mRNA; B: TLR4蛋白. 1: 对照组; 2: LPS组; 3: CRF组; 4: CRF+LPS组; 5: CRF+Antalarmin组; 6: CRF+LPS+Antalarmin组.

图2 各组HT-29细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达及CRF2受体拮抗剂干预结果. A: TLR4 mRNA; B: TLR4蛋白. 1: 对照组; 2: LPS组; 3: CRF组; 4: CRF+LPS组; 5: CRF+Astressin2B组; 6: CRF+LPS+Astressin2B组.

图3 各组细胞中IL-8的表达. 1: 对照组; 2: LPS组; 3: CRF组; 4: CRF+LPS组; 5: CRF+Antalarmin组; 6: CRF+LPS+Antalarmin组; 7: CRF+Astressin2B组; 8: CRF+LPS+Astressin2B组.

2.2 CRF1受体拮抗剂Antalarmin对CRF诱导的TLR4表达的影响

CRF+Antalarmin组中TLR4 mRNA和蛋白表达水平与CRF组比较, 差异无统计学意义(1.01±0.03 vs 1.05±0.06, 1.01±0.16 vs 1.08±0.21, P>0.05); CRF+LPS+Antalarmin组与CRF+LPS相比较, 亦无显著性差异(1.62±0.04 vs 1.68±0.05, 1.78±0.21 vs 1.81±0.18, 图1).

2.3 CRF2受体拮抗剂Astressin2B对CRF诱导的TLR4表达的影响

CRF+Astressin2B组中TLR4 mRNA和蛋白表达水平与CRF组比较, 两组之间差异有统计学意义(0.29±0.03 vs 1.05±0.06, 0.48±0.26 vs 1.08±0.21, P<0.05), CRF+LPS+Astressin2B组与CRF+LPS组比较, 两组之间差异亦有统计学意义(0.31±0.06 vs 1.68±0.05, 0.51±0.22 vs 1.81±0.18, P<0.05, 图2).

3 讨论

近年研究发现CRF信号系统活化可能是压力诱发或加剧炎症性肠病的机制[8], 已经证实肠道活化的CRF信号可以导致促炎反应, 并有研究发现肽聚糖诱导的结肠炎组织中CRF表达是增高的; 相反CRF缺陷小鼠肠道炎症反应会减轻[9], 溃疡性结肠炎组织中CRF表达也增高, 但是增高的CRF是如何导致炎症发生并不清楚. 已有研究显示CRF可以促进单核细胞释放趋化因子, 巨噬细胞释放IL-6、TNF-α、IL-1[10], 但对肠上皮细胞的作用了解甚少.

肠上皮细胞暴露于高浓度的细菌及共栖菌, 对腔内细菌的识别是肠腔内环境稳定的关键. 而TLR对宿主的保护起着重要作用, 他们通过启动先天性免疫反应调整对细菌病毒的适应性免疫[11,12]. 研究显示, 正常结肠上皮细胞中TLR4呈低表达水平, 对LPS反应很弱, 但在炎症性肠病肠黏膜组织中呈现显著高表达[13,14]. TLR4低水平表达及信号微弱是肠上皮细胞的适应性免疫调节, 使肠上皮免遭对腔内细菌不必要的免疫反应所引起的组织破坏, 因此TLR4与腔内共栖菌之间的调节信号对于增强保护, 促进损伤修复, 维持肠黏膜的正常屏障作用至关重要[15].

本研究显示正常肠上皮细胞中LPS不能刺激TLR4表达增高, 但是CRF刺激组TLR4 mRNA和蛋白表达水平则增高, 提示CRF可以促进肠上皮细胞中TLR4表达, 而CRF刺激后再次以LPS刺激则TLR4 mRNA和蛋白表达水平显著增高, 提示CRF不仅可直接刺激结肠上皮TLR4增高, 还可促进结肠上皮对LPS反应增加, 进而促进TLR4表达增高. 而肠上皮细胞中TLR4表达增高可导致对腔内细菌免疫耐受异常, 导致对LPS的反应增加, 引起促炎因子IL-8释放增多[16]. 我们进一步检测各组细胞中IL-8水平, 发现与TLR4活化一致, 也相应增高.

CRF肽家族的受体分为CRF1型受体和CRF2型受体, 二者均属于G蛋白耦联受体, 胃肠组织中均有CRF1受体和CRF2受体分布, CRF与不同受体结合而发挥不同的生物学效应. 例如胃排空与CRF2受体有关, 结肠动力与CRF1受体有关[17], CRF2受体缺陷性小鼠肠道炎症是减轻的[18]. 但是CRF在结肠上皮中对TLR4的调节作用通过何种受体尚不清楚. 我们对以上实验分别以CRF1受体拮抗剂和CRF2受体拮抗剂进行干预阻滞发现, CRF2受体拮抗剂可有效阻滞CRF对TLR4的诱导表达, 而CRF1受体拮抗剂不能有效地阻滞, 与TLR4表达水平一致的肠上皮细胞分泌IL-8的变化, 均提示CRF对结肠上皮细胞TLR4的诱导有可能是通过CRF2受体通路.

近年已有发现TLR4抗体可以减轻实验性结肠炎中的炎症反应[19], 有效阻滞TLR4的活化已成为近年为减轻炎症性肠病中肠道炎症的治疗热点. 而本实验明确CRF在结肠上皮中对TLR4的调节作用以及通过的受体途径, 将为明确应激导致炎症的发生以及可能的治疗提供理论基础.

评论

背景资料

越来越多临床观察及实验数据发现, 心理压力不仅可以导致功能性肠病的发生, 也可诱发或加剧器质性疾病如炎症性肠病的产生, 但是压力等应激因素是如何导致肠黏膜免疫紊乱并不清楚.

同行评议者

杜奕奇, 副教授, 中国人民解放军第二军医大学长海医院

研发前沿

促肾上腺皮质释放因子(CRF)是一个重要的应激因子, 不仅中枢组织中有表达, 周围组织也存在, 近年已发现肠黏膜组织中也有CRF的表达, 并发现其与炎症发生有关.

相关报道

TLR4作为先天性免疫与获得性免疫的桥梁, 在肠上皮细胞对腔内共栖菌的稳定中起着关键作用. 肠黏膜TLR4的表达调控异常可导致肠黏膜炎症的发生.

创新盘点

本实验通过研究CRF在结肠上皮中对TLR4的调节作用以及通过的受体途径, 将为明确应激导致炎症的发生提供理论基础.

同行评价

本研究立意较新, 研究结果对阐明IBD的发病机制有一定意义, 结论可靠, 统计学正确, 为今后进一步开展体内研究奠定了基础.

备注

编辑:张姗姗 电编:鲁亚静

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