miR-451对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

摘要

目的: 探讨miR-451对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响.

方法: 化学合成miR-451 mimics, 脂质体包裹转染EC9706细胞为miR-451组, 同时设立无关序列(Scramble-miR)对照组、脂质体对照组和空白对照组. 转染后48 h, 荧光定量RT-PCR检测miR-451表达量的变化, Western blot检测Bcl-2、AKT和磷酸化AKT蛋白表达水平, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况, Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变; MTT法检测转染后l、2、3、4、5、6 d各组细胞增殖率.

结果: miR-451组的miR-451表达水平显著上调(P<0.01, F = 69.26), 为空白对照组的15.84倍; miR-451组细胞Bcl-2、AKT和磷酸化AKT蛋白表达均显著下调(P<0.05, F = 5.83); miR-451组细胞凋亡率为12.07%±1.12%, 与3个对照组比较显著升高(P<0.01, F = 26.72); miR-451组平均侵袭细胞数为47.4±7.4, 与3个对照组比较显著降低(P<0.01, F = 34.55). miR-451组细胞的生长在转染后2 d出现显著抑制(P<0.05, F = 5.95), 并且随时间的延长而日益显著.

结论: 上调miR-451表达可抑制食管癌EC9706细胞增殖和侵袭, 促进细胞凋亡.

关键词: 食管癌细胞系; miR-451; 增殖; 凋亡; 侵袭

Overexpression of miR-451 inhibits cell proliferation and invasion and promotes apoptosis in human esophageal carcinoma cell line EC9706

Hong Leng, Wen-Qiao Zang, Tao Wang, Yuan-Yuan Wang, Jing Ma, Guo-Qiang Zhao

Hong Leng, Department of Immunology and Pathogen Biology, Luoyang Vocational & Technical College, Luoyang 471000, Henan Province, China

Wen-Qiao Zang, Yuan-Yuan Wang, Jing Ma, Guo-Qiang Zhao, Basic Medical College, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China

Tao Wang, Department of Hemato-Oncology, the First Affiliated Hospital of Henan College of TCM, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Correspondence to: Guo-Qiang Zhao, Professor, Department of Microbiology and Immunology, Basic Medical College, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China. zhaogq@zzu.edu.cn

Received: February 21, 2012
Revised: March 13, 2012
Accepted: April 19, 2012
Published online: May 28, 2012

Abstract

AIM: To explore the effect of overexpression of miR-451 on cell proliferation, apoptosis and invasion in human esophageal carcinoma cell line EC9706.

METHODS: MiR-451 mimics were constructed and transfected into EC9706 cells using LipofectamineTM2000. EC9706 cells transfected with Scramble-miR, empty liposomes or negative miR-451 were used as controls. Forty-eight hours after transfection, the expression of miR-451 was detected by RT-PCR, and the expression of Bcl-2, AKT and phosphorylated AKT proteins were detected by Western blot. Cell apoptosis, invasion and proliferation were assessed by flow cytometry, transwell assay and MTT assay, respectively.

RESULTS: Compared to control cells, the expression of miR-451 was significantly up-regulated (P < 0.01, F = 69.26); the expression of Bcl-2, AKT and phosphorylated AKT proteins was significantly down-regulated (P < 0.05, F = 5.83); cell apoptosis rate significantly increased (P < 0.01, F = 26.72); the average number of cells penetrating Matrigel membrane significantly decreased (P < 0.01, F = 34.55); and cell proliferation was significantly suppressed in a time-dependent manner (P < 0.05, F = 5.95) in EC9706 cells transfected with miR-451 mimics.

CONCLUSION: Over-expression of miR-451 induces apoptosis and suppresses cell proliferation and invasion in human esophageal carcinoma cell line EC9706.

Key Words: Esophageal cancer cells; MiR-451; Proliferation; Apoptosis; Invasion

0 引言

肿瘤是目前对人类生命和健康危害最严重的疾病之一, 但其发生发展的确切机制仍未完全阐明. 非蛋白质编码微小RNA(microRNA, miRNA)的发现为肿瘤研究提供了新的思路. miRNA是真核细胞内源性非编码的单链小分子、由约22个核苷酸组成、参与转录后基因调控, 可特异性识别靶mRNA的3'UTR并与之结合, 引起靶mRNA的降解或翻译抑制, 从而对基因进行转录后表达调控, 参与调节细胞活动, 具有重要的生理及病理意义[1,2]. 近期有研究显示, miR-451在食管癌中表达下调[3], 但miR-451在食管癌中的具体作用仍然不明确. 为此, 本研究利用合成的miR-451转染食管癌EC9706细胞, 探讨和分析miR-451对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

人食管癌细胞株EC9706由郑州大学基础医学院保存; RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco BRL公司; Lipofectamine^TM2000、TRIzol购自Invitrogen公司; MIT购自Sigma公司; Annexi V细胞凋亡检测试剂盒购自Abcam公司; Matrigel购自BD公司; Transwell板购自Corning公司; miR-451 qPCR Quantitation Kit购自上海吉玛制药技术有限公司; miR-451 mimics(5'-AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3', 3'-CUCAGUAAUGGUAACGGUUUUU-5'), miRNA无关序列对照(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', 3'-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA -5'), 购自上海生工生物有限公司; Aktl、p27和GAPDH抗体购自Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1 实验分组和miR-451转染: 将食管癌EC9706细胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基, 37 ℃、50 mL/L CO₂、饱和湿度条件培养. 选用对数生长期细胞按照实验分组分别进行脂质体转染. (1)miR-451组, 加入miR-451 mimics 100 nmol/L和脂质体; (2)miRNA无关序列对照组, 加入miR scramble 100 nmol/L和脂质体; (3)脂质体对照组, 仅加入脂质体; (4)空白对照组, 无任何转染. 转染后培养6 h, 换含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640完全培养基, 37 ℃、50 mL/L CO₂、饱和湿度条件培养48 h, 收集细胞进行各项检测.

1.2.2 荧光定量RT-PCR检测: 采用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA, 使用miR-451 qPCR Quantitation Kit进行逆转录和PCR扩增, 该试剂盒内有茎环结构样的miR-451特异逆转录引物, 他能与miRNA的3'端结合并使逆转录, 避免miRNA前体的干扰, 反转录反应体系为: 5×RT buffer 4 μL, 4×dNTP 1 μL, miR-RT primer 1 μL, M-MLV 0.5 μL, 总RNA 1 μL, RNaseFree H₂O补足20 μL. 逆转录反应程序: 37 ℃ 60 min, 85 ℃ 10 min. PCR扩增体系为: 2×Real-time PCR buffer 20 μL, miR specific primer set 1 μL, miRNA逆转录产物1 μL, Taq酶0.2 μL, ddH₂O补足40 μL. 定量PCR反应程序: 95 ℃ 3 min预变性; 95 ℃ 15 s, 65 ℃ 45 s, 40个循环. 所有反应均设3个复孔, 以U6作为内参, 记录Ct值, 各组间miR-451相对定量的倍数(relative fold, RF)用2^-△△Ct值表示.

1.2.3 MTT检测细胞增殖: 胰酶消化对数生长期的EC9706细胞, 按104个细胞/孔接种于96孔培养板(200 μL/孔), 接种12 h后, 常规转染; 分别于接种后l、2、3、4、5、6 d, 每孔中加入MTT溶液20 μL(5 g/L), 37 ℃条件下再培养4 h, 弃上清, 每孔加DMSO 200 μL, 振摇20 min; 570 nm波长下, 用紫外分光光度计测定各孔吸光度(A)值, 每组设6个复孔; 计算各组细胞增殖率(细胞增殖率 = 转染细胞A值/空白对照细胞A值×100%)

1.2.4 细胞凋亡检测: 将转染后48 h的各组细胞用胰酶充分消化成单细胞悬液, 4 ℃ 1 000 r/min离心5 min, 弃上清, PBS洗涤, 调整细胞密度为1×10⁶/mL. 按照Annexin V/PI试剂盒说明书进行染色, 使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况, 每组细胞重复检测3次.

1.2.5 Transwell实验: 按照Corning公司Transwell小室说明书操作, 制备细胞悬液, 加于Transwell小室(每孔200 µL培养液, 1×10⁵细胞). 24孔板下室加入500 µL含FBS或趋化因子的培养基. 常规培养48 h, 结晶紫染色, 显微镜观察和拍照, 随机选5个视野, 计数取平均值.

1.2.6 Western blot检测蛋白表达: 收集各组细胞, 制备细胞总蛋白, SDS-PAGE凝胶电泳. 电转移的方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上, 以AKT蛋白抗体为一抗, 辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗检测AKT蛋白、磷酸化AKT、Bcl-2蛋白的表达, 以GAPDH为内参照.

统计学处理 实验数据使用SPSS17.0统计软件包, 多项指标间单采用因素方差分析, 两指标间进一步比较采用LSD-t检验; 按照P<0.05作为检验水准.

2 结果

2.1 实时定量荧光PCR

各实验组实时定量荧光PCR检测数值见表1, 其中miR-451组的miR-451表达水平显著上调(P<0.01), 为空白对照组的15.84倍; 而miRNA无关序列对照组和脂质体对照组的miR-451表达水平无显著改变(P>0.05).

表1 各实验组miR-451表达相对值比较 (mean±SD).

分组	Ct miR-451	Ct U6	△Ct	△△Ct	2-△△Ct
miR-451组	22.29±0.69	13.01±0.47	9.28±0.24	-3.97±0.29	15.84±3.07b
miRNA无关序列对照组	24.50±0.39	11.43±0.30	13.07±0.14	-0.17±0.08	1.13±0.06
脂质体对照组	24.61±0.40	11.51±0.44	13.09±0.12	-0.15±0.05	1.11±0.04
空白对照组	24.67±0.31	11.42±0.30	13.24±0.07	0	1

^bP<0.05 vs 空白组、脂质体对照组.

2.2 细胞增殖检测

与空白对照组比较, 转染后l、2、3、4、5、6 d, 脂质体对照组和miRNA无关序列对照组细胞的生长未受到显著抑制(P>0.05), 而miR-451组细胞的生长在转染后2 d后出现显著抑制(P<0.05), 并且随时间的延长而日益显著(图1).

图1 各组细胞增殖率.

2.3 凋亡检测

AnnexinV/Pl染色方法检测空白对照组、脂质体对照组和miRNA无关序列对照组细胞的凋亡率分别为4.81%±1.20%、4.33%±2.89%、4.60%±2.63%; miR-451组细胞凋亡率为12.07%±1.12%, 与空白对照组、脂质体对照组和miRNA无关序列对照组细胞的凋亡率比较显著升高, 差异均有显著性(P<0.05).

2.4 Transwell实验

空白对照组、脂质体对照组和miRNA无关序列对照组视野平均侵袭细胞数分别为106.2±15.7、105.6±13.7和108.8±10.1; miR-451组视野平均侵袭细胞数为47.4±7.4, 与3个对照组比较显著降低, 差异有显著性(P<0.01).

2.5 Western blot检测

空白对照组、脂质体对照组和miRNA无关序列对照组细胞Bcl-2、AKT和磷酸化AKT蛋白表达一致, 差异无显著性(P<0.05); 而miR-451组与3个对照组比较均显著下调, 差异有显著性(P<0.05, 图2).

图2 Western bolt检测Bcl-2、AKT和pAKT蛋白表达. 1: miR-451组; 2: miRNA无关序列对照组; 3: 脂质体对照组; 4: 空白对照组. ^aP<0.05 vs miR-451组.

3 讨论

miR-451是Altuvia等[4]在2005年利用生物信息学方法发现和命名, miR-451位于染色体17qll.2, 与miR-144相邻. 目前认为miR-451的主要功能是参与造血系统分化、胚胎成熟、上皮细胞极性的形成和神经系统发育. 新近研究发现, miR-451与多种肿瘤密切相关, 不仅在肿瘤组织中表达异常, 而且还显示其参与某些肿瘤的生物学行为和药耐基因的调控.

2009年, Bandres等[5]采用实时定量PCR方法检测21例胃癌组织中miRNAs表达, 并分析其与临床病理的关系, 结果显示胃癌和结肠癌上皮细胞的miR-451表达降低; 分析发现miR-451与预后不良相关; 胃癌细胞AGS和结肠癌上皮细胞DLD1转染miR-451能降低细胞扩增及增加放射敏感性. Hui等[6]采用实时定量PCR方法对51例头部和颈部鳞状细胞癌标本和3个头颈部鳞癌细胞株进行miRNA表达谱检测, 并分析临床病理相关性, 发现miR-451是唯一显著高表达的miRNA, 复发患者比未复发患者高4.7倍. Wang等[7]用miRNA芯片检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织miRNAs表达谱, 发现miR-451下调最显著, 在NSCLC中miR-451表达与肿瘤分化、病理分期及淋巴结转移相关; 高表达miR-451可显著抑制NSCLC体外增殖、集落形成和裸鼠移植瘤生长. Heinzelmann等[8]研究证实肾透明细胞癌中miR-451表达显著降低. 刘辉等[3]采用AgilentTM高通量的microRNA微阵列芯片对食管癌组织及其癌旁组织的miRNA表达的差异进行分析, 结果显示包括miR-451在内的8个miRNA表达显著下调. Zhu等[9]研究显示, 在多药耐药卵巢癌细胞系A2780DX5中miR-27a和miR-451表达上调. 用miR-27a和miR-451的抑制剂antagomirs处理A2780DX5细胞后, 可有效增加细胞对毒药物的敏感性. Bian等[10]研究发现NSCLC中miR-451过表达能显著抑制A549细胞的增长并诱导凋亡, 此外, miR-451能增加A549细胞对顺铂化疗的敏感性, 提出顺铂联合miR-451可能是NSCLC治疗的潜在策略.

目前发表的文献资料显示, miR-451在胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胶质瘤、肾透明细胞癌、食管癌中表达下调, 而在头部和颈部鳞状细胞癌、多药耐药卵巢癌中表达上调. 由于1个miRNA可以调控多个基因, 不同的miRNA分子也可以协同调控同1个基因; 在机体内, miRNA与其靶标基因之间实际上是一个复杂的调控网络, 控制细胞及个体的重要生命活动. 因此, 在不同类型肿瘤中miR-451的表达水平和作用也可能是不同的. 本实验结果显示上调食管癌EC9706细胞中miR-451表达, 可有效抑制食管癌EC9706细胞的增殖和侵袭能力, 并且促进细胞的凋亡. 该结果与Tian等[11]在恶性胶质瘤细胞系和吴春蓉等[12]在肠癌细胞系的实验结果一致.

PI3K/AKT是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号传导通路之一[13,14]. 生理状态下, AKT以低活性或失活状态存在于细胞浆; 当暴露于各刺激因素时, AKT在PI3K调节作用下发生磷酸化而激活, 激活的AKT与相应部位的底物蛋白作用, 使底物蛋白磷酸化, 导致细胞存活/增殖, 并保护细胞逃避凋亡[15-18]. 本实验Western blot证实在上调miR-451表达的食管癌EC9706细胞中, Bcl-2、AKT和磷酸化AKT蛋白表达均降低, 并且磷酸化AKT蛋白在总AKT蛋白中所占的比例亦降低. 提示上调miR-451表达可抑制食管癌EC9706细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡, 该作用可能是通过PI3K/Akt信号传导通路实现的, 有待进一步研究证明.

评论

背景资料

miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用, 他们在正常组织和肿瘤组织中的表达显著不同. 近期的研究发现, 一些miRNA在肿瘤细胞中表达明显减少, 提示着这些分子可能作为抑癌分子.

同行评议者

刘云鹏, 教授, 中国医科大学附属第一医院肿瘤内科

创新盘点

本研究利用合成的miR-451转染入食管癌EC9706细胞, 发现上调miR-451表达可抑制食管癌EC9706细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡.

同行评价

选题有一定的创新性, 为食管癌以及其他肿瘤的临床诊治提供了一定的参考.

备注

编辑:张姗姗 电编:闫晋利

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