基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2012. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2012-04-18; 20(11): 923-929
在线出版日期: 2012-04-18. doi: 10.11569/wcjd.v20.i11.923
低表达Smad4对肝癌细胞SMMC-7721上皮间质转化的影响
薛慧婷, 王宏刚, 黄晓丹, 沈鹏, 季国忠
薛慧婷, 王宏刚, 黄晓丹, 沈鹏, 季国忠, 南京医科大学第二附属医院消化医学中心 南京医科大学消化内镜研究所 江苏省南京市 210011
薛慧婷, 硕士, 主要从事肝癌发病机制的研究.
基金项目: 江苏省卫生厅科技基金资助项目, No. H201009; 南京医科大学科技发展基金资助项目, No. 2010NJMUZ54; 江苏省六大人才高峰基金资助项目, No. 2009041; 南京市科技发展基金资助项目, No. 201104029.
作者贡献分布: 此课题由薛慧婷、王宏刚、黄晓丹及季国忠设计; 实验操作由薛慧婷、王宏刚及沈鹏完成; 数据分析由薛慧婷完成; 论文写作由薛慧婷与黄晓丹完成.
通讯作者: 季国忠, 教授, 210011, 江苏省南京市下关区姜家园121号, 南京医科大学第二附属医院消化医学中心, 南京医科大学消化内镜研究所. jgzzl@163.com
电话: 025-58509996
收稿日期: 2012-01-15
修回日期: 2012-02-15
接受日期: 2012-03-06
在线出版日期: 2012-04-18

目的: 探讨低表达Smad4调控上皮间质转化影响肝癌细胞(hepatocellular carcinoma cells, HCC)侵袭转移的相关机制.

方法: 采用Western blot法观察低表达Smad4对β-catenin和Vimentin总蛋白表达水平的影响; 逆转录PCR法测定低表达Smad4后, β-catenin和Vimentin mRNA表达的变化; 细胞免疫荧光法检测Smad4、β-catenin和Vimentin在肝癌细胞SMMC-7721及其转染组中的定位及荧光表达强度.

结果: 低表达Smad4后, 相较于CON组和RNAi-NC组, 在转染组RNAi-Smad4-2和RNAi-Smad4-12细胞中, β-catenin mRNA和相应总蛋白的表达水平明显增加(P<0.05), 并促使其发生了核转位的改变; 另一方面, 在RNAi-Smad4-2和RNAi-Smad4-12两转染组细胞中, Vimentin的蛋白表达水平和相应胞浆荧光的表达强度比对照组明显下调(P<0.05), 相应mRNA的表达水平在肝癌SMMC-7721细胞及其转染组无显著差异.

结论: 低表达Smad4可调控上皮间质转化相关标志物β-catenin和Vimentin的表达, 发挥抑制肝癌SMMC-7721细胞上皮间质转化的作用.

关键词: Smad4; 肝癌细胞; 上皮向间质转化; β-catenin; Vimentin
引文著录: 薛慧婷, 王宏刚, 黄晓丹, 沈鹏, 季国忠. 低表达Smad4对肝癌细胞SMMC-7721上皮间质转化的影响. 世界华人消化杂志 2012; 20(11): 923-929
Loss of Smad4 expression inhibits epithelial-mesenchymal transition in SMMC-7721 cells
Hui-Ting Xue, Hong-Gang Wang, Xiao-Dan Huang, Peng Shen, Guo-Zhong Ji
Hui-Ting Xue, Hong-Gang Wang, Xiao-Dan Huang, Peng Shen, Guo-Zhong Ji, Institute of Digestive Endoscopy and Medical Center for Digestive Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China
Supported by: the Science and Technology Program of Health Department of Jiangsu Province, No. H201009; the Science and Technology Innovation Foundation of Nanjing Medical University, No. 2010NJMUZ054; the Six Talents Peak Foundation of Jiangsu Province, No. 2009041; and the Program of Science and Technology of Nanjing, No. 201104029.
Correspondence to: Guo-Zhong Ji, Professor, Institute of Digestive Endoscopy and Medical Center for Digestive Disease, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China. jgzzl@163.com
Received: January 15, 2012
Revised: February 15, 2012
Accepted: March 6, 2012
Published online: April 18, 2012

AIM: To investigate the influence of loss of Smad4 expression on TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition in the human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721.

METHODS: The influence of loss of Smad4 expression on the expression of β-catenin and Vimentin mRNAs and proteins was evaluated by RT-PCR and Western blot. Immunofluorescence was used to analyze the location and fluorescence intensity of Smad4, β-catenin, Vimentin in non-transfected SMMC-7721 cells and those transfected with Smad-specific siRNAs (RNAi-Smad4-2 and RNAi-Smad4-12) or unspecific siRNA (RNAi-NC).

RESULTS: Compared to non-transfected SMMC-7721 cells and those tranfected with RNAi-NC, the expression of β-catenin mRNA and protein remarkably increased in SMMC-7721 cells transfected with RNAi-Smad4-2 or RNAi-Smad4-12 (all P < 0.05). Loss of Smad4 expression promoted β-catenin nuclear translocation. Immunofluorescence assay revealed that β-catenin fluorescence was located in the nuclei of non-transfected SMMC-7721 cells and those tranfected with RNAi-NC, but in the cytoplasm of SMMC-7721 cells transfected with RNAi-Smad4-2 or RNAi-Smad4-12. On the other hand, loss of Smad4 expression down-regulated Vimentin protein expression (P < 0.05) and cytoplasmic fluorescence intensity, but had no significant impact on Vimentin mRNA expression in SMMC-7721 cells and those transfected with different siRNAs.

CONCLUSION: Loss of Smad4 expression regulates β-catenin and Vimentin and therefore plays an important role in inhibiting epithelial-mesenchymal transition in SMMC-7721 cells.

Key Words: Smad4; Hepatocellular carcinoma cell; Epithelial-mesenchymal transition; β-catenin; Vimentin
0 引言

肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一, 其中90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC). 全球每年的肝癌新发病例数为74.8万, 死亡数为69.6万[1,2]. 我国是全球肝癌发病率最高的国家, 在常见肿瘤中肝癌发病率居第2位[3,4]. HCC症状不明显, 早期诊断率较低, 5年生存率小于5%, 确诊时多数已发展为中晚期, 发生远处扩散转移[5]. 因此, 研究HCC侵袭转移的发生机制, 对改善肝癌患者预后、延长患者生存期, 具有重要的意义. 肿瘤的侵袭、转移受多种因素的调控和影响, 近几年发现上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一个关键因素[6]. EMT是指有极性的上皮细胞失去其上皮细胞的表现型, 转化成具有活动能力的间质细胞生物学特征的过程. 他与胚胎发育、创口愈合和肿瘤侵袭转移等密切相关[7,8]. 越来越多的证据[9,10]表明TGF-β1是引发EMT的关键始动因素, 在EMT过程中发挥关键作用. TGF-β信号通路的核心是Smad4, 有研究发现在多种肿瘤中, Smad4与EMT的发生密切相关[11,12], 但两者在肝癌组织中的关系国内外尚无相关报道.

本研究拟观察在肝癌细胞SMMC-7721中, 低表达Smad4对TGF-β1诱发EMT的影响, 初步探讨低表达Smad4引起细胞迁移和侵袭能力改变的相关作用机制, 以期为进一步解释HCC的侵袭转移机制提供实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所; 小鼠抗人Smad4单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司; 鼠抗人Vimentin单克隆抗体购自美国abcam公司; 兔抗人β-catenin单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司; 小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗购自武汉博士德公司; 重组人TGF-β1购自美国R&D Systems公司; 山羊抗鼠/兔IgG(H&L)-FITC购自武汉博士德公司; 逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司; PCR试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司; TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞转染: 课题组前期[13]构建的Smad4 RNA干扰(RNA interference, RNAi)慢病毒载体, 经包装、浓缩及检测病毒滴度后感染肝癌细胞SMMC-7721, 筛选出两组Smad4干扰效率高的细胞, RNAi-Smad4-2组和RNAi-Smad4-12组, 对照组为肝癌细胞CON和感染慢病毒空载体的肝癌细胞RNAi-NC.

1.2.2 细胞培养: CON组、RNAi-NC组及转染组细胞, 以含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养基, 于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养, 胰酶消化、传代, 取对数生长期细胞实验.

1.2.3 细胞计数: 在24孔板中接种3×104个/孔的CON组细胞悬液, 培养至70%融合时, 用无血清的培养基同步化24 h, 分为5组, 分别用0 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L的TGF-β1孵育, 0 h、24 h、48 h、72 h后分别计数.

1.2.4 Western blot检测Smad4、β-catenin和Vimentin蛋白的表达: 提取细胞总蛋白, BCA法测定各组蛋白浓度. 根据浓度上样行电泳后, 转膜至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h, 加一抗(β-actin 1∶500、Smad4 1∶300、Vimentin 1∶500、β-catenin 1∶1 000)4 ℃杂交过夜, TBST漂洗, 加二抗(1∶2 000)室温孵育2 h, TBST漂洗, 化学发光试剂检测蛋白条带, 测定各条带积分吸光度(A)值, 定量分析.

1.2.5 RT-PCR检测β-catenin和Vimentin mRNA的表达: 用PBS洗涤各组细胞3次, 每孔中加入1 mL TRIzol RNA提取液, 按说明书步骤提取总RNA, 紫外分光光度仪测A260/A280的比值, 重复3次, 计算RNA浓度. 将RNA逆转录为cDNA后进行循环扩增. PCR引物由美国Invitrogen公司上海分公司合成, 引物序列: GAPDH上游引物5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3', 下游引物5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'; β-catenin上游引物5'-GCTGCTGTTTTGTTCCGAATGT-3', 下游引物5'-GCCATTGGCTCTGTTCTGAAGA-3'; Vimentin上游引物5'-CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC-3', 下游引物5'-GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA-3'.

反应条件均为: 95 ℃, 3 min预变性; 94 ℃, 30 s; 48 ℃, 30 s, 72 ℃, 1 min, 35个循环; 72 ℃终末延伸5 min. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶图像扫描系统成像并进行灰度扫描, 用GAPDH的表达量校正, 将两者A值的相对量进行分析, 重复3次.

1.2.6 细胞免疫荧光法检测Smad4、β-catenin和Vimentin的表达: 0.01%多聚赖氨酸处理盖玻片, 高压灭菌后备用. 在6孔板中分别加入一片处理好的盖玻片, 将细胞接种于此(细胞分组情况同前, 每组设3个孔). 待上述各组SMMC-7721细胞在盖玻片上生长融合到90%-95%时, 取4%多聚甲醛固定细胞15 min, 0.5% Triton X-100透化4 min, 5% BSA/PBS封闭20 min, 加入一抗Smad4、β-catenin(1∶120), Vimentin(1∶200), 4 ℃ 2 h, PBS漂洗, 加入二抗避光孵育1 h, 晾干、封片, 奥林巴斯正置荧光显微镜观察蛋白定位表达情况.

统计学处理 所有实验均重复3次以上, 用SPSS 18.0软件进行统计分析, 定量结果采用mean±SD表示, 多组均数间比较采用单因素方差分析, 两两组间比较采用组间q检验, 以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 细胞计数CON组在不同浓度、不同时间点的TGF-β1刺激下的生长

在1、5、10 μg/L浓度的TGF-β1孵育下, 细胞呈浓度依赖性增长; TGF-β1浓度达到20 μg/L后, 细胞增长的趋势明显减弱, 且有抑制现象. 而在同一浓度TGF-β1刺激下的CON组细胞, 在0 h、24 h、48 h时间点, 呈时间依赖性增长, 48-72 h间, 细胞增长趋势明显减弱, 即10 μg/L TGF-β1孵育48 h时, 细胞增殖幅度达顶峰(表1), 后续实验遂采用此浓度和时间点处理细胞.

表1 计数CON组在不同浓度、不同时间点TGF-β1刺激下相 对前1 d的细胞增长差值(×104/mL).
0 μg/L1 μg/L5 μg/L10 μg/L20 μg/L
0 h3.03.03.03.03.0
24 h5.78.215.422.918.9
48 h13.015.319.126.817.8
72 h5.36.29.011.28.3
2.2 低表达Smad4基因后其相应蛋白的表达

与CON组(1.60±0.06)及RNAi-NC组(1.60±0.14)相比, RNAi-Smad4-12组(1.15±0.02)和RNAi-Smad4-2组(0.45±0.11)细胞中Smad4蛋白表达明显降低(P<0.05, 图1); 而CON组和RNAi-NC组细胞间比较, Smad4蛋白的表达无明显差异.

图1
图1 Western blot法检测SMMC-7721细胞敲低Smad4基因后相应蛋白的表达. aP<0.05 vs CON组和RNAi-NC组; 1: CON; 2: RNAi-NC; 3: RNAi-Smad4-12; 4: RNAi-Smad4-2.
2.3 低表达Smad4对β-catenin总蛋白的影响

与CON组和RNAi-NC组相比, TGF-β1刺激前RNAi-Smad4-2和RNAi-Smad4-12组β-catenin蛋白表达明显升高(P<0.05). 加入10 μg/L TGF-β1孵育细胞48 h后, CON组和RNAi-NC组β-catenin蛋白表达都较未处理时明显减少, RNAi-Smad4-12组相对减少, 而RNAi-Smad4-2组减少的趋势不显著(P<0.05, 图2).

图2
图2 各Western blot法检测TGF-β1刺激前后对Smad4敲低表达组β-catenin总蛋白表达的影响. aP<0.05 vs 未受刺激的CON组和RNAi-NC组; cP<0.05 vs TGF-β1孵育48 h后的CON组和RNAi-NC组; 1: CON; 2: RNAi-NC; 3: RNAi-Smad4-12; 4: RNAi-Smad4-2; A,B: β-catenin; C, D: β-actin.
2.4 低表达Smad4对Vimentin蛋白表达的影响

TGF-β1刺激前RNAi-Smad4-2和RNAi-Smad4-12组Vimentin蛋白表达相较于CON组和RNAi-NC组明显减少(P<0.05). 加入10 μg/L TGF-β1孵育细胞48 h后, CON组和RNAi-NC组Vimentin表达都较未处理时明显升高, RNAi-Smad4-12组相对升高, 而RNAi-Smad4-2组升高则不显著(P>0.05, 图3).

图3
图3 Western blot法检测TGF-β1刺激前后Smad4敲低表达组Vimentin蛋白的表达. aP<0.05 vs 未受刺激的CON组和RNAi-NC组; cP<0.05 vs TGF-β1孵育48 h后的CON组和RNAi-NC组; 1: CON; 2: RNAi-NC; 3: RNAi-Smad4-12; 4: RNAi-Smad4-2; A, B: Vimentin; C, D: β-actin.
2.5 低表达Smad4对β-catenin和Vimentin mRNA表达的影响

以GAPDH作为内参照, 各组β-catenin mRNA相对表达量分别为: CON组(0.91±0.01), RNAi-NC组(0.81±0.01), RNAi-Smad4-12组(1.30±0.22), RNAi-Smad4-2组(1.19±0.01). 与CON组及RNAi-NC组相比, 2个转染组β-catenin mRNA表达明显升高(P<0.05, 图4A). 4组间的Vimentin mRNA的表达无明显差异(P>0.05, 图4B).

图4
图4 RT-PCR法检测Smad4低表达后β-catenin和Vimentin mRNA的表达. aP<0.05 vs CON组和RNAi-NC组; A: β-catenin; B: Vimentin; 1: CON; 2: RNAi-NC; 3: RNAi-Smad4-12; 4: RNAi-Smad4-2.
2.6 Smad4细胞荧光表达

免疫荧光染色结果显示, CON组和RNAi-NC组的Smad4表达在细胞浆处, 转染组的Smad4胞浆表达明显减少(图5).

图5
图5 Smad4细胞荧光的表达. A, B, C, D: Smad4; E, F, G, H: DAPI核染; A, E: CON; B, F: RNAi-NC; C, G: RNAi-Smad4-12; D, H: RNAi-Smad4-2.
2.7 低表达Smad4对β-catenin和Vimentin荧光表达的影响

CON组和RNAi-NC组的β-catenin主要表达在细胞核上, 胞浆几乎缺如; RNAi-Smad4-12和RNAi-Smad4-2组则主要定位于胞浆处, 细胞核上表达明显减少, β-catenin有明显的核转位变化. 而Vimentin在4组细胞中都主要定位于细胞浆和细胞膜上, 2个转染组的Vimentin细胞荧光表达较CON组和RNAi-NC组减弱, 核转位改变不明显(图6).

图6
图6 Smad4敲低表达后β-catenin和Vimentin荧光表达. A-H: β-catenin; I-P: Vimentin; A, B, C, D, I, J, K, L: β-catenin/Vimentin; E, F, G, H, M, N, O, P: DAPI核染; A, E, I, M: CON; B, F, J, N: RNAi-NC; C, G, K, O: RNAi-Smad4-12; D, H, L, P: RNAi-Smad4-2.
3 讨论

EMT主要的特征包括[14]: 上皮标志物表达的下调(E-cadherin、β-catenin等), 间质标志物表达的上调(Vimentin、N-cadherin等), 角蛋白为主的细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架, 以及形态由上皮细胞转化为具有间充质特征的细胞等. 其中上皮标志物β-catenin表达的下调和间质细胞标志物Vimentin表达的增加是EMT发生的一个重要标志. β-catenin是分子量为92 KDa的一种多功能蛋白, 研究[15]表明, 由β-catenin与cadherin形成的蛋白复合物在细胞-细胞以及细胞-基质的相互关系中具有关键作用. 当β-catenin表达上调时, 增强细胞间的黏附作用, 使细胞不容易发生侵袭和转移; 相反, 当β-catenin表达下调时, 细胞间的黏附作用被破坏, 细胞更容易发生侵袭和转移. 而Vimentin是分子量为57 KDa的波形蛋白, 构成成纤维细胞中的中间纤维, 是细胞骨架成分, 具有调节细胞骨架蛋白、细胞黏附分子等蛋白间的相互作用, 在很多间叶组织中表达, 在EMT过程中可作为间叶组织的标志[16].

越来越多的证据表明, EMT参与多种肿瘤的侵袭和转移过程, 包括乳腺癌[17,18]、前列腺癌[19]、肝癌[20]、结肠癌[21]、肺癌[22]及宫颈癌[23]等, 而且肿瘤组织中发生EMT的肿瘤细胞数目与病变组织的侵袭转移程度有关[20].

EMT的发生受到诸多因素的影响[24,25], 其中TGF-β是引发EMT的关键始动因素[26,27], 并且参与EMT的全过程. Smad4分子是TGF-β-Smad信号通路中的关键应答分子, 处于TGF-β信号转导的中枢地位, 他能够参与调控多种下游靶基因的表达[28]. 课题组前期[13]采用RNAi技术, 构建了针对Smad4的RNAi慢病毒载体, 使Smad4低表达并转染SMMC-7721细胞, 成功构建了多组低表达Smad4的SMMC-7721细胞. 前期研究发现, 低表达Smad4后SMMC-7721细胞的侵袭和迁移能力增加.

近年来的研究表明, Smad4在多种肿瘤进展、侵袭和转移中起重要作用[29,30]. EMT参与多种肿瘤侵袭转移的过程, 有研究[12,31,32]发现, Smad4参与肿瘤组织的EMT过程. 由此提出Smad4是否通过EMT介导细胞迁移和侵袭能力从而影响HCC的侵袭和转移的假设.

本实验中, 通过Western blot法来验证Smad4基因敲低后相应蛋白的表达情况, 显示2个转染组相较于对照组都有不同程度的减少; 细胞免疫荧光结果也显示, 转染组的Smad4在细胞浆上的荧光表达较CON组和RNAi-NC组明显减少, 均证实了转染的成功性和稳定性. 进一步研究结果显示: 与对照组相比, Smad4低表达会上调β-catenin mRNA和总蛋白表达量; 下调Vimentin蛋白表达量, Vimentin mRNA表达未受明显影响. 利用免疫荧光技术, 发现低表达Smad4会使Vimentin在胞浆中的表达出现不同程度的缺失, β-catenin发生核转位. 这些研究均表明低表达Smad4会抑制EMT的发生. 当用10 μg/L TGF-β1孵育细胞48 h后, 空白对照组和转空组β-catenin总蛋白表达量都较未处理时明显减少, 而转染组减少的程度并不显著, Vimentin蛋白表达量在用TGF-β1刺激后则与β-catenin结果相悖. 众所周知, TGF-β1经由依赖Smad4途径和包括Wnt、Ras、MAPK等多条通路的非依赖Smad4途径[33-35]诱导了EMT的发生, 当低表达Smad4后, 极大程度地抑制了依赖Smad4途径, TGF-β1可能即循非依赖Smad4途径诱导了EMT的发生. 而在转染组中, 低表达Smad4会潜在抑制非依赖性途径诱发EMT的现象, 又再次证明了依赖性途径在TGF-β1诱发EMT过程中的主要性[36,37].

总之, 本实验的研究结果表明在肝癌细胞SMMC-7721中, 低表达Smad4可能通过抑制TGF-β1诱发的EMT来改变肝癌细胞的侵袭转移能力.

评论
背景资料

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在胚胎发育、创口愈合和肿瘤侵袭转移中起着重要作用. Smad4是TGF-β通路的关键分子, 研究发现Smad4与多种肿瘤的侵袭转移密切相关.

同行评议者

倪润洲, 教授, 南通大学附属医院消化内科

研发前沿

早期转移和复发是延长肝癌患者生存期、提高远期疗效的瓶颈问题. 肿瘤细胞通过EMT而实现转移过程, 是近年来肿瘤领域的研究热点.

应用要点

进一步明确EMT在HCC中的侵袭转移发生中的作用, 探讨HCC的侵袭转移机制, 将有利于早期预测预防肝癌转移发生, 从而提高肿瘤患者的生存率.

创新盘点

本文创新性地在肝癌细胞SMMC-7721中, 初步探讨了Smad4通过调控EMT从而影响HCC侵袭和转移的机制.

同行评价

本文创新性地将TGF-β和Wnt/β-catenin信号通路联系在一起来研究肝癌细胞株SMMC-7721中Smad4表达水平降低后对EMT的影响, 进而探讨了其在HCC侵袭转移中的作用意义, 该文研究水平较高, 创新性强.

编辑: 张姗姗 电编: 鲁亚静

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