研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-04-08; 20(10): 856-860
在线出版日期: 2012-04-08. doi: 10.11569/wcjd.v20.i10.856
低分子肝素对伴高脂血症急性坏死性胰腺炎大鼠PAF、ET-1/NO的影响
王湘英, 卢义展, 张兴文, 骆永富, 王强
王湘英, 骆永富, 王强, 湖南省人民医院肝胆外科 湖南省长沙市 410005
卢义展, 湖南省湘西自治州人民医院普外科 湖南省吉首市 416000
张兴文, 湖南省人民医院急诊科 湖南省长沙市 410005
王湘英, 主任医师, 主要从事重症急性胰腺炎的基础与临床研究.
基金项目: 长沙市科技计划基金资助项目, No. k0803152-31.
作者贡献分布: 此课题由王湘英与卢义展设计; 研究过程由卢义展操作完成; 张兴文参与实验指导; 数据分析由卢义展与骆永富完成; 本论文写作由王湘英、卢义展及王强完成.
通讯作者: 王湘英, 教授, 主任医师, 410005, 湖南省长沙市, 湖南省人民医院肝胆胰外科. ylwqboy@tom.com
电话: 0731-82278153
收稿日期: 2011-12-26
修回日期: 2012-01-17
接受日期: 2012-03-15
在线出版日期: 2012-04-08

目的: 研究低分子肝素(LMWH)治疗伴高脂血症性急性胰腺炎(HL-AP)大鼠微循环障碍的作用.

方法: SD大鼠80只, 高脂饲料喂养4 wk建立高脂血症模型后, 随机分成3组: 假手术(S)组, n = 16; NS对照(N)组, n = 32; 低分子肝素(L)组, n = 32. N组与L组大鼠建立ANP模型, S组大鼠仅开腹翻动胰腺. L组造模后分别于0 h, 6 h, 12 h及18 h开始使用LMWH皮下注射. N、S组同时点同方法用生理盐水对照, 24 h后抽门静脉检测血小板活化因子(PAF)、内皮素-1(ET-1)/一氧化氮(NO)浓度并行电镜观察胰腺组织微循环结构.

结果: L组PAF、ET-1/NO浓度分别为5.9250 mmol/L±0.6113 mmol/L及3.5368±0.26; N组为7.4059 mmol/L±0.4281 mmol/L及4.1697±0.08; SO组为4.4950 mmol/L±0.2628 mmol/L及2.5133±0.20; L组PAF、ET-1/NO浓度均低于N组但高于SO组, 有统计学意义; L组中0 h及6 h开始用LMWH的大鼠PAF、ET-1/NO浓度低于12 h及18 h组, 有统计学意义. 电镜观察L组胰腺病变程度轻于N组.

结论: 高脂血症急性胰腺炎大鼠存在胰腺微循环障碍; LMWH可以改善高脂血症大鼠SAP胰腺微循环障碍, 并且早期应用优于晚期应用.

关键词: 低分子肝素; 高脂血症; 重症急性胰腺炎; 微循环
引文著录: 王湘英, 卢义展, 张兴文, 骆永富, 王强. 低分子肝素对伴高脂血症急性坏死性胰腺炎大鼠PAF、ET-1/NO的影响. 世界华人消化杂志 2012; 20(10): 856-860
Treatment with low-molecular-weight heparin reduces blood levels of PAF and ET-1/NO in rats with severe acute pancreatitis and hyperlipemia
Xiang-Ying Wang, Yi-Zhan Lu, Xing-Wen Zhang, Yong-Fu Luo, Qiang Wang
Xiang-Ying Wang, Yong-Fu Luo, Qiang Wang, Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, the People's Hospital of Hunan Province, Changsha 410005, Hunan Province, China
Yi-Zhan Lu, Department of General Surgery, the People's Hospital of Xiangxi Autonomous Prefecture, Jishou 416000, Hunan Province, China
Xing-Wen Zhang, Department of Emergency Medicine, the People's Hospital of Hunan Province, Changsha 410005, Hunan Province, China
Supported by: the Science Project of Changsha, No. k0803152-31.
Correspondence to: Xiang-Ying Wang, Professor, Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, the People's Hospital of Hunan Province, Changsha 410005, Hunan Province, China. ylwqboy@tom.com
Received: December 26, 2011
Revised: January 17, 2012
Accepted: March 15, 2012
Published online: April 8, 2012

AIM: To investigate the effect of treatment with low-molecular-weight heparin (LMWH) on microcirculation dysfunction in rats with severe acute pancreatitis (SAP) and hyperlipemia.

METHODS: SD rats were fed a high-fat diet for four weeks to induce hyperlipemia and randomly divided into sham operation group, control group, and experimental group. The control group and experimental group were then used to induce SAP, while the sham operation group underwent a sham operation. At 0, 6, 12 and 18 h after SAP induction, the experimental group was subcutaneouly injected with LMWH, and the control group was injected with normal saline. The concentrations of PAF and ET-1/NO in the portal vein blood were measured, and pancreatic microcirculatory structure was observed by electron microscopy.

RESULTS: The concentrations of PAF and ET-1/NO in the experimental group (5.9250 mmol/L ± 0.6113 mmol/L, 3.5368 ± 0.26) were significantly lower than those in the control group (7.4059 mmol/L ± 0.4281 mmol/L, 4.1697 ± 0.08), but were significantly higher than those in the sham operation group (4.4950 mmol/L ± 0.2628 mmol/L, 2.5133 ± 0.20). In addition, treatment with LWMH improved pancreatic microcirculation.

CONCLUSION: Treatment with LMWH improves pancreatic microcirculation in rats with SAP and hyperlipemia.

Key Words: Low-molecular-weight heparin; Hyperlipemia; Severe acute pancreatitis; Microcirculation
0 引言

随着高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia, HTG)的发病率逐渐升高, 由其导致的高脂血症性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis, HL-AP)的病例数也在不断增加, 成为继胆源性和酒精性胰腺炎的第3大原因, 占全部胰腺炎病因的1%-4%[1]. HL-AP并发症多、易反复发作, 重症化率高, 其诊治具有自身特点. 近年来研究提示微循环障碍是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)的启动因子和持续损害因子, 而高脂血症作为急性胰腺炎的独立危险因素, 可通过多种途径加重微循环障碍, 加剧胰腺损伤, 因此改善胰腺微循环的治疗显得尤为突出[2-4].

1 材料和方法
1.1 材料

SD大鼠80只, 清洁级,♂, 体质量180-200 g, 湖南农业大学动物实验中心提供, 许可证编号SCXK(湘)2006-0001; 高脂饲料: 胆固醇2%(天津市光复精细化工研究所)、猪油10%(湖南农大动物实验中心), 普通饲料88%(湖南农大动物实验中心提供); 牛磺胆酸钠: 原药购自Sigma公司, 粉针剂, 1 g/支, 纯度99%, 实验前每支加入蒸馏水20 mL配置成5%的溶液; 低分子肝素: 尤尼舒注射剂, 5 000 IU, 1 mL/支, 海南通用同盟药业有限公司; 一氧化氮试剂盒(酶法): 北京四柏正生物有限公司; Rat ET-1 ELISA Kit: 武汉新启迪生物科技有限公司; Rat PAF ELISA Kit: 武汉新启迪生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 HL模型建立: 80只♂SD大鼠高脂饲料喂养4 wk[喂养前后均行尾静脉取血0.5 mL测甘油三酯(triglyceride, TG)浓度, 前后比较升高3倍以上, HL成模], 再随机(抽签法)分为3组: 假手术组(SO), n = 16; NS对照组(N), n = 32; LMWH组(L), n = 32. 其中L组和N组再随机分成0 h, 6 h, 12 h及18 h 4个亚组, 每个亚组8只.

1.2.2 ANP模型建立: N、L组大鼠均行逆胰胆管注射法建立SAP模型. 建模前禁食12 h, 禁饮4 h. 采用10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉, 取上腹正中线切口入腹, 于乳头对侧十二指肠壁无血管区刺一小孔, 将处理消毒后的硬膜外导管(直径约0.5 mm)沿十二指肠刺孔经乳头开口置入胰胆管内, 匀速泵入5%的牛磺胆酸钠, 观察8 min后松开血管夹并拔管, 缝线缝合十二指肠穿刺孔, 滴医用创面封闭胶1滴, 关腹. SO组仅开腹翻动胰腺. 3组大鼠成模后每6 h常规补充生理盐水(2 mL/100 g), 至成模后24 h.

1.2.3 干预: L组大鼠ANP成模后按亚组分别于0 h, 6 h, 12 h及18 h开始于左侧腹壁皮下注射LMWH(尤尼舒注射剂, 5 000 IU, 1 mL/支, 海南通用同盟药业), 0.2 mL/100 g(100 IU/kg), 每6 h重复注射1次, 至成模后24 h. N组同时点同方法采用等量的生理盐水对照. SO组仅常规补液, 无其他干预.

1.2.4 标本采集与检测: 3组动物分别于制模后24 h再次麻醉, 无菌条件下取门静脉血4.0 mL -5.0 mL, 置于-20 ℃冰箱中密封保存待测. 获取血液标本后, 切取十二指肠内侧胰腺组织0.1×0.1×0.2 cm3, 予2.5%戊二醛溶液固定. 采用酶联免疫吸附法检测血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)、内皮素-1(endothelin-1, ET-1)浓度; 采用硝酸还原酶法检测NO浓度; 全自动生化检测仪检测血TG; 胰腺组织送透射电镜行病理组织学检查.

统计学处理 实验检测数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 资料用SPSS16.0统计软件进行统计学处理. 完全随机设计资料的多个样本均数比较采用ANOVA分析; 同一受试对象接受处理前后用配对t检验; 两因素相关分析采用Person法. 以P<0.05认为资料具有统计学差异, P<0.01认为具有统计学显著差异.

2 结果
2.1 大鼠喂养前后血TG变化

SO组高脂饲料喂养4 wk前后TG浓度分别为0.492 mmol/L±0.051 mmol/L及1.590 mmol/L±0.321 mmol/L; N组分别为0.501 mmol/L±0.094 mmol/L及1.603 mmol/L±0.257 mmol/L; L组分别为0.526 mmol/L±0.051 mmol/L及1.597 mmol/L±0.238 mmol/L; 3组大鼠高脂饲料喂养4 wk后TG浓度均较喂养前升高达3倍以上, 有统计学差异(表1).

表1 3组大鼠喂养前后血TG浓度变化 (mean±SD).
分组nTG(mmol/L)
喂养前喂养后
SO组160.492±0.0511.590±0.321b
N组320.501±0.0941.603±0.257b
L组320.526±0.0511.597±0.238b
bP<0.01 vs 喂养前.
2.2 大体观察

对照组大鼠可见大量红色或暗红色血性腹水, 大网膜、肝十二指肠韧带、肠系膜, 甚至壁腹膜上均可见到成片分布的皂化斑, 全胰腺充血、水肿, 片状出血及坏死灶; 实验组大鼠可见黄色微浊腹水, 散在分布的皂化斑, 点状出血及坏死灶; SO组大鼠偶见少量无色清亮腹水, 未见皂化斑及胰腺坏死.

2.3 门静脉血PAF、ET-1/NO(E/N)浓度

N组大鼠ANP成模后与SO组比较血PAF、ET-1/NO(E/N)升高(P<0.01), 有统计学意义; L组ANP成模后与N组比较血PAF、ET-1/NO(E/N)降低(P<0.01), 有统计学意义(表2).

表2 3组大鼠门静脉血PAF、ET-1/NO(E/N)变化 (mean±SD).
分组nPAF浓度(mmol/L)ET-1浓度(mmol/L)NO浓度(mmol/L)E/N比值
SO组164.4950±0.262852.4346±2.76720.9032±0.7362.5133±0.20
N组327.4059±0.4281b178.4358±1.343b42.8069±0.757b4.1697±0.08b
L组325.9250±0.6113d120.1321±1.309d33.8764±1.904d3.5368±0.26d
bP<0.01 vs SO组;
dP<0.01 vs N组.
2.4 胰腺组织电镜观察

SO组内皮完整, 未见血栓; N组大鼠血栓形成, 腺体细胞线粒体水肿, 滑面内质网扩张明显; L组大鼠微血管内皮连续, 未见血栓(图1A-C, 电镜×5 000); SO组管腔结构正常, 亚细胞结构正常; N组胰腺细胞部分线粒体水肿空泡化, 微血管血栓形成; L组可见微血管, 腺体细胞个别线粒体水肿, 内质网无扩张(图1D-F, 电镜×10 000).

图1
图1 各试验组大鼠的胰腺病理变化. A, B: SO组; C, D: N组; E, F: L组. A, C, E: 电镜×5 000; B, D, F: 电镜 ×10 000.
3 讨论

HL-AP既表现出胰腺炎的共性, 又有其自身的特殊性, 国内外的研究亦证实, HL是引起AP的独立危险因素, 且TG水平与病变程度存在着显著的相关性[2,3]. 高脂血症影响胰腺微循环的途径可能有: (1)血液黏度增高致血液流变学改变; (2)血清脂质颗粒聚集栓塞胰腺微血管; (3)胰腺毛细血管中高浓度胰脂肪酶使血清TG释放大量游离脂肪酸, 致毛细血管内膜损伤[5,6]. 而微循环障碍作为SAP的启动因子和持续损害因子, 高脂血症更加加重了胰腺微循环障碍, 导致胰腺炎病情加剧. 在AP早期阶段, 大量炎症细胞被激活, 导致促炎症因子及炎症介质被释放, 如ET-1、NO、PAF和氧自由基等等, 其中的血管活性物质参与了AP时微动脉痉挛、渗出、及出血坏死的发展[7]. PAF可影响微血管管径、通透性, 同时激活血小板, 促进微血管血栓形成, 血小板激活在SAP中扮演着重要角色, 且与HL-SAP的严重程度相关[8]. ET-1是一种极强的收缩血管物质, 他是HL-SAP微循环障碍的重要介导因子, 对于HL-SAP进展和并发症的产生有重要作用[9]; NO是目前所知的一种最强的舒血管介质[10], 二者一旦失衡, 就会使胰腺微血管运动失调, 引发微循环障碍. 因此可以认为ET/NO比例失调, 胰腺血管舒缩调节失衡是AP向SAP发展的一个重要促进因素[11].

本实验结果显示: N组PAF、ET-1浓度明显高于S组, 具有统计学差异(P<0.01), 支持高脂血症胰腺炎存在微循环障碍. NO具有拮抗ET-1及舒张胰腺微血管的作用, 但过高的NO浓度也能损害胰腺微循环. 在实验结果中, N组NO的浓度高于S组(P<0.01), 但升高的幅度(2.1倍)不及ET-1升高的幅度(3.5倍), 提示胰腺微循环障碍启动后, 存在胰腺微循环损害因子的血浆浓度过高, 微循环损害因子与保护因子的比值(E/N)失衡, 损伤及抗损伤机制被破坏, 造成胰腺微循环障碍. 由于这种调节的存在, 二者的比值(即E/N)将更有利于对胰腺微循环障碍损害程度的判断.

LWMH可保护血管内皮细胞, 维持内皮细胞的完整, 拮抗内皮细胞释放ET-1, 能促使内皮细胞释放组织纤溶酶原激活物, 抑制血栓素的活化, 发挥纤溶和抗血栓作用[12,13]. Berger等[14]对5例HL-SAP患者持续静脉推注低分子肝素和胰岛素, 全部患者血TG值降至2.8 mmol/L以下, 无1例并发症和死亡发生. Qiu等[15]用LMWH治疗ANP大鼠, 证实LMWH能通过调节炎症反应和抗血栓作用而改善胰腺微循环; 并且通过临床前瞻性研究证实在SAP常规治疗的基础上加用LMWH能够有效改善病情, 提高治疗效果和降低病死率[16]. 本研究结果显示L组PAF、ET-1浓度均低于N组(P<0.05), 透射电镜观察L组大鼠胰腺腺泡细胞空泡化少见, 点状坏死, 微血栓少见, 提示LMWH干预HL-ANP大鼠有效.

关于SAP时LMWH开始使用的时间, 目前国内外研究暂无定论, 但有临床研究主张在发病的48 h以内根据病情开始使用. SAP早期应用LMWH能明显改善胰腺微循环血流, 其机制可能为减少血小板聚集, 缓解微血管痉挛及降低血液黏稠度等; 后期由于胰腺损伤的加重, 微血管内微血栓已经形成, 而LMWH主要作用为抗凝而非溶栓, 故即使使用LMWH也不能逆转胰腺微循环血流量及血流速度的降低. 本研究通过LMWH干预试验发现, L组大鼠各时段中0 h、6 h时段组LMWH干预后PAF、ET-1浓度及胰腺组织病理学评分均低于12 h、18 h时段组, 透射电镜观察结果前者好于后者. 提示LMWH早期干预较晚期干预效果更好. 但目前在临床应用上尚存在LMWH给药具体时间、次数以及对凝血功能的影响等问题, 这还有待于进一步探索.

评论
背景资料

随着生活水平提高, 高甘油三酯血症所导致的高脂血症性急性胰腺炎(hyperlipidemia and acute pancreatitis, HL-AP)病例不断增加, 高脂血症已成为AP胆源性和酒精性之外的第3大原因, 其治疗已成为临床探讨的热点课题.

同行评议者

樊晓明, 教授, 主任医师, 复旦大学附属金山医院消化科

研发前沿

HL-AP病情重、并发症多、易复发, 传统治疗方法存在诸多不足. 应用低分子肝素可以一定程度地改善HL-AP微循环. 探索改善HL-AP预后的途径成为临床研究热点.

创新盘点

本研究应用低分子肝素时段干预对HL-AP大鼠PAF、ET-1/NO的影响, 探索低分子肝素改善微循环治疗高脂血症急性胰腺炎机制.

名词解释

微循环: 微动脉与微静脉之间的血液循环通路, 他是机体细胞代谢的重要场所.

同行评价

本文立题新颖, 紧密结合临床, 实验设计严谨, 方法实用, 为临床应用低分子肝素治疗HL-AP提供理论依据和实验基础.

编辑: 张姗姗 电编: 闫晋利

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