修回日期: 2011-04-13
接受日期: 2011-04-26
在线出版日期: 2011-05-08
目的: 探讨microRNA(miR)-145是否通过调控c-Myc参与肝癌行为的调控.
方法: 实时定量PCR检测肝组织及细胞系miR-145表达水平; 检测不同肝组织c-Myc的mRNA和蛋白表达量; 通过转染上调miR-145在HepG2细胞表达后, 检测转染前后空白组、实验组、阴性对照组HepG2中c-Myc的mRNA和蛋白表达量; 应用流式细胞仪检测转染前后各组HepG2的凋亡情况.
结果: miR-145 mRNA在正常肝组织中表达明显高于癌旁和肝癌组织(0.878±0.146 vs 0.265±0.084, 0.271±0.096, 均P<0.05); 癌旁和肝癌组织中miR-145 mRNA的表达量差别无统计学意义. miR-145 mRNA在LO-2中的表达明显高于HepG2(0.755±0.185 vs 0.471±0.074, P<0.05). c-Myc mRNA和蛋白在癌旁和肝癌中表达均高于正常肝组织(mRNA: 0.136±0.071, 0.451±0.026 vs 0.029±0.023; 蛋白: 0.301±0.022, 0.445±0.018 vs 0.137±0.011, 均P<0.05), 且在肝癌组织中表达量较癌旁组织中明显升高(P<0.05). 转染miR-145 mimics后空白组、实验组、阴性对照组c-Myc mRNA表达差异无统计学意义; 而相对于空白组和阴性对照组, 实验组c-Myc蛋白表达量表达明显下降(0.146±0.011 vs 0.366±0.014, 0.350±0.013, 均P<0.05), 空白组和阴性对照组之间差异无统计学意义. 流式细胞术检测发现, 在HepG2中上调miR-145的表达后, 细胞的凋亡明显增多, 实验组与空白组和阴性对照组之间有明显差异(3.000±0.100 vs 1.167±0.153, 0.933±0.208, 均P<0.05).
结论: miR-145反向调节c-Myc的表达; 表达下调的miR-145丧失对c-Myc的抑制可能是肝癌发生的重要机制; miR-145能够作为抑癌基因促进细胞凋亡.
引文著录: 由法平, 宋孟锜, 陈立波. 低表达的microRNA-145对c-Myc表达的影响. 世界华人消化杂志 2011; 19(13): 1411-1416
Revised: April 13, 2011
Accepted: April 26, 2011
Published online: May 8, 2011
AIM: To investigate whether microRNA-145 (miR-145) controls hepatoma progression through modulating c-Myc activity.
METHODS: Quantitative real-time PCR was used to detect miR-145 expression in different liver lesions and cell lines. Quantitative real-time PCR and Western blot were adopted to detect the expression of c-Myc mRNA and protein in different liver lesions, respectively. After transfection of HepG2 cells with an miR-145 mimic, quantitative real-time PCR, Western blot and flow cytometry were used to detect the expression of c-Myc mRNA and protein and cell apoptosis, respectively.
RESULTS: MiR-145 mRNA was underexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC) and tumor-adjacent tissue compared to normal liver tissue (0.878 ± 0.146 vs 0.265 ± 0.084, 0.271 ± 0.096, both P < 0.05). MiR-145 mRNA was also underexpressed in HepG2 cells compared to L-02 cells (0.755 ± 0.185 vs 0.471 ± 0.074, P < 0.05). C-Myc mRNA and protein were overexpressed in HCC and tumor-adjacent tissue compared to normal liver tissue (mRNA: 0.136 ± 0.071, 0.451 ± 0.026 vs 0.029 ± 0.023; protein: 0.301 ± 0.022, 0.445 ± 0.018 vs 0.137 ± 0.011; all P < 0.05). C-Myc protein expression was down-regulated in HepG2 cells transfected with an miR-145 mimic compared to cells transfected with empty vector and untransfected cells (0.146 ± 0.011 vs 0.366 ± 0.014, 0.350 ± 0.013, both P < 0.05). Transfection of an miR-145 mimic promoted the apoptosis of HepG2 cells compared to cells transfected with empty vector and untransfected cells (3.000 ± 0.100 vs 1.167 ± 0.153, 0.933 ± 0.208, both P < 0.05).
CONCLUSION: MiR-145 down-regulation-mediated ablation of inhibition of c-Myc may be a major cause of hepatocarcinogenesis. MiR-145 can promote cell apoptosis.
- Citation: You FP, Song MQ, Chen LB. Down-regulation of microRNA-145 ablates c-Myc inhibition and promotes hepatoma progression. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2011; 19(13): 1411-1416
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v19/i13/1411.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v19.i13.1411
MicroRNA(miRNA)是22 nt左右的微小RNA, 通过RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)与靶基因mRNA的3'UTR区互补结合降解或者抑制靶基因mRNA的翻译从而影响靶基因蛋白的表达[1,2]. 越来越多的证据表明在人类许多肿瘤中都存在miRNA的异常表达. 例如, miR-15a、miR-16-1在慢性淋巴细胞白血病中[3,4], miR-143、miR-145在结直肠癌中[5], let-7在肺癌中[6], miR-155在弥漫性大B细胞淋巴瘤中均有异常表达[7]. miRNA的作用很强大, 研究表明每个miRNA与相当数量的基因有联系(平均每个miRNA家族作用于500个基因)[8-11]. 例如miR-21在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、CLL、AML的均表达上调[12-17]; miR-34a、miR-34b、miR-34c在结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌膀胱癌、神经母细胞瘤[18]等肿瘤中表达下调. 异常表达的miRNA[19-21]通过类似于癌基因/抑癌基因功能调控着肝癌的发生发展. 在结肠癌和乳腺癌中有报道P53通过诱导miR-145抑制c-Myc的表达[22], 但miR-145在肝癌中的表达水平以及其与c-Myc之间的关系还未见报道. c-Myc是肝癌发生进展中的关键癌基因, 因而探讨肝癌中miR-145和c-Myc的关系具有重要的价值. 本文通过检测不同肝组织及肝癌细胞系miR-145、c-Myc mRNA及c-Myc蛋白的表达量以及功能学研究, 初步探讨肝癌中miR-145与c-Myc表达异常的关系及miR-145在肝癌发生中的生物学行为.
18例正常肝组织, 53例肝癌组织来源于2009-08-15/2010-11-08在华中科技大学同济医学院附属协和医院门诊肝组织活检, 肝外伤破裂及肝癌切除病例. 所有病例均为35-45岁男性患者, 肝癌患者术前未接受化疗治疗, 最后病理结果诊断明确. 标本切除后30 min以内放入-80 ℃保存备用. LO-2细胞和HepG2细胞均由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外实验室冻存, 按常规培养; c-Myc一抗(鼠抗人)购自美国Santa Cruz公司; mRNA实时定量PCR试剂盒购自Invitrogen公司; 引物由Invitrogen公司合成; 凋亡试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(KeyGEN, China)购自凯基公司.
1.2.1 实时定量PCR检测肝脏组织及细胞中miRNA-145 mRNA的表达: 应用TRIzol分别提取组织和细胞的总RNA, 逆转录得到cDNA后进行实时定量PCR. 引物设计资料: hsa-miR-145 MIMAT0000437 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU, 正向特异性引物5'-GTCCAGTTTTCCCAGGA-3'; 内参U6正向特异性引物5'-CTCGCTTCGGCAGCAC A-3'; 反应参数设置: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 10 s, 扩增40个循环. 所得数据用2-ΔΔCt公式校正后再评定个样本之间的差异.
1.2.2 实时定量PCR检测肝脏组织和细胞中c-Myc mRNA的表达量: 应用TRIzol一步法提取各肝组织中总RNA, 逆转录得到cDNA, 然后进行实时定量PCR反应, c-Myc上、下游引物序列分别为5'-CGTCTCCACACATCAGCACAA-3'和5'-TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT-3', 内参β-actin正向引物5'-GAACGGTGAAGGTGACAG-3', 反向引物5'-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3', 反应参数设置: 95 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s; 72 ℃ 30 s, 循环45次; 72 ℃ 5 min[23], 所得数据用2-ΔΔCt公式校正后用来评定各样本间的差异.
1.2.3 Western blot检测肝组织及肝细胞中c-Myc蛋白表达量: 各肝脏组织取0.5 mg, 收集六孔板中融合达80%的细胞提取总蛋白, 采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)测定总蛋白浓度, 将定量的蛋白以每孔20-40 µg加样于SDS-PAGE凝胶上样孔中, 200 V电泳至溴酚蓝迁移到距分离胶底部0.5 cm处, 关闭电源; 用300 mA转膜70 min; 将电转膜置于5%的脱脂奶粉(PBS配置)中封闭, 37 ℃振荡2 h; 后加入1:400 c-Myc一抗1 mL, 4 ℃孵育过夜, PBST漂洗3次, 后加入1: 5 000 HRP标记的二抗(用含5%脱脂奶粉的PBS稀释)室温下摇床孵育1 h, PBST漂洗3次, 化学发光显影, 胶片曝光, 结果用UVP扫描仪扫描成像.
1.2.4 转染miR-145 mimics对HepG2细胞中miR-145表达的影响: 取稳定生长的对数生长期的HepG2细胞消化计数, 以平均每孔5.0×105个细胞种植于6孔板中, 分空白组、实验组、阴性对照组, 空白组加无血清无抗生素Opti-MEM培养基2 mL, 实验组加终浓度为50 nmol/L的miR-145 mimics(广东锐博)和5 μL Lipofectamine 2000(Invitrogen), 阴性对照组加终浓度为50 nmol/L的阴性对照试剂(广东锐博)和5 μL Lipofectamine 2000(Invitrogen), 后各组均用Opti-MEM培养基调至2 mL, 转染步骤严格按说明书执行, 转然24 h后检测各组c-Myc的mRNA表达; 48 h后检测各组c-Myc蛋白的表达.
1.2.5 流式检测转染miR-145 mimics后HepG2细胞的凋亡: 用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(KeyGEN, China)严格按说明书处理细胞. 将转染48 h后的各组细胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化后离心收集细胞, PBS洗涤细胞两次, 离心收集细胞; 加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞, 加入5 μL Annexin V-FITC混匀, 加入5 μL Propidium Iodide, 混匀; 室温, 避光, 反应15 min; 用FACScan进行流式细胞术定量检测, 最后用CELL Quest软件进行数据分析.
统计学处理 各组实验重复3次数据经SPSS18.0软件分析, 计量资料采用mean±SD表示, 组间计量资料采用t检验和方差分析(One-Way ANOVA, LSD method), 以P<0.05为具有统计学意义.
miR-145 mRNA在正常肝脏, 癌旁及肝癌组织中的表达量分别为0.878±0.146, 0.265±0.084, 0.271±0.096(图1A); miR-145 mRNA在LO-2和HepG2细胞系中表达量分别为0.755±0.185, 0.471±0.074; miR-145 mRNA在正常肝组织中表达明显高于癌旁和肝癌组织(均P<0.05); 癌旁和肝癌组织中miR-145 mRNA的表达量差别无统计学意义. miR-145 mRNA在LO-2中明显高于HepG2中的表达(P<0.05).
实时定量PCR结果显示正常肝组织, 癌旁组织和肝癌组织中mRNA的表达量分别为: 0.029±0.023, 0.136±0.071, 0.451±0.026(图1B); Western blot显示在正常肝组织, 癌旁组织和肝癌组织中蛋白表达量分别为0.137±0.011, 0.301±0.022, 0.445±0.018(图2). 统计结果显示c-Myc mRNA和蛋白在癌旁和肝癌中表达均高于正常肝组织(P<0.05), 且在肝癌组织中表达量较癌旁组织中明显升高(P<0.05).
根据患者性别、年龄、原发肿瘤大小、分化程度、是否合并肝内子灶、血清AFP及HbsAg检测结果进行分组, 定量比较各组中miR-145的表达状况. 统计结果显示miR-145 mRNA表达量与患者的性别、年龄及肿瘤的大小无关(P>0.05), 但与肝癌分化程度、是否合并肝内转移子灶有关(P<0.05), 与患者血清AFP的浓度及是否合并HBV感染有关(P<0.05, 表1).
| 病理参数 | n | miR-145的表达量 | P值 |
| 性别 | |||
| 男 | 39 | 0.278±0.096 | >0.05 |
| 女 | 14 | 0.252±0.095 | |
| 年龄(岁) | |||
| >50 | 21 | 0.278±0.098 | >0.05 |
| <50 | 32 | 0.267±0.095 | |
| 肿瘤大小(cm) | |||
| <3 | 11 | 0.321±0.089 | >0.05 |
| >3 | 42 | 0.258±0.094 | |
| 分化程度 | |||
| 好 | 16 | 0.315±0.098 | <0.05 |
| 差 | 37 | 0.252±0.089 | |
| 肝内转移子灶 | |||
| 有 | 12 | 0.204±0.048 | <0.05 |
| 无 | 41 | 0.291±0.094 | |
| AFP浓度(μg/L) | |||
| <400 | 18 | 0.310±0.084 | <0.05 |
| >400 | 35 | 0.252±0.096 | |
| HbsAg | |||
| 阳性 | 39 | 0.254±0.095 | <0.05 |
| 阴性 | 14 | 0.318±0.082 |
转染miR-145 mimics 24 h后提取总RNA, 进行实时定量PCR检测空白组、实验组、阴性对照组c-Myc mRNA表达量分别为2.614±0.863, 2.382±0.769, 2.771±0.614; 转染48 h后提取总蛋白Western blot检测空白组、实验组、阴性对照组c-Myc蛋白的表达量分别为0.366±0.014, 0.146±0.011, 0.350±0.013(图3). 统计结果显示, 转染miR-145 mimics后空白组、实验组、阴性对照组c-Myc mRNA表达差异无统计学意义; 而相对于空白组和阴性对照组, 实验组c-Myc蛋白表达量明显下降(P<0.05), 空白组和阴性对照组之间差异无统计学意义.
转染miR-145 mimics后48 h行流式细胞术定量检测HepG2细胞的凋亡水平: 在HepG2中上调miR-145的表达后, 细胞的凋亡明显增多(图4). 空白对照组、实验组、阴性对照组细胞凋亡率分别为1.167±0.153, 3.0±0.1, 0.933±0.208, 实验组与空白组和阴性对照组之间有明显差异(P<0.05).
迄今为止, 人类有近15%-20%的基因受c-Myc的直接或间接的调控, 这些基因与细胞的周期调控、蛋白合成、细胞结构的形成、运动性、代谢等等有关[24], 共同调控着细胞的生长、分化和凋亡[25]. 基因分析在病毒相关性肝癌及酒精相关性肝癌中有70%的患者存在c-Myc的高表达[26]; 早已有报道c-Myc能直接上调miR-17-92簇的表达, 促进肿瘤的发生发展[27]; Chang等[28]在此研究的基础上发现在B细胞淋巴瘤中有超过10种miRNA的表达受c-Myc的调控, 染色体免疫共沉淀研究证实c-Myc能与miRNA的上游保守序列或启动子序列特异性结合, 抑制miRNA的表达, 促进肿瘤的发展. 因此c-Myc的异常表达与肿瘤有密切的关系. 但c-Myc的异常表达机制的原因尚不明确, 是否受miRNA的调控仍不明确. 有报道在HeLa细胞中研究发现let-7能特异性结合c-Myc的3'UTR在mRNA和蛋白水平抑制c-Myc的表达[29]; 生理状态下P53能够直接作用于miR-34家族抑制c-Myc的表达诱导细胞周期停止和细胞凋亡[30], 等等. 在结肠癌和乳腺癌中曾有报道c-Myc是miR-145的直接作用靶点[22], 且P53通过诱导miR-145表达能调控c-Myc的表达. 但在肝癌中miR-145与肝细胞癌之间类似的关系尚未见报道, 是否miR-145同样反向调控c-Myc的表达尚不清楚.
我们发现miR-145 mRNA在正常肝组织中表达明显高于癌旁和肝癌组织; c-Myc mRNA和蛋白在癌旁和肝癌中表达均高于正常肝组织, 且在肝癌组织中表达量较癌旁组织中明显升高, 提示c-Myc的异常高表达可能与miR-145异常低表达有关; 临床病理参数显示miR-145的低表达与患者的性别、年龄及肿瘤大小无关, 与肿瘤的分化程度、是否合并HBV感染和肝内转移子灶及患者血清AFP浓度等有关, 提示miR-145低表达的患者, 肿瘤恶性程度高、容易转移, 预后较差; 由于miRNA-145 mRNA在LO-2中明显高于HepG2中的表达, 我们利用miR-145 mimics转染HepG2细胞, 上调miR-145的表达量进一步验证了, miR-145能够在蛋白水平抑制c-Myc的表达, 但在mRNA水平实验组与空白组及阴性对照组无明显差异. 结合在组织中miR-145与c-Myc的异常表达, 提示在肝癌中miR-145能反向调控c-Myc的表达, 进一步研究发现上调miR-145还能促进肝癌细胞凋亡.
总之, 我们的研究证实了在肝癌中miR-145与c-Myc的关系及miR-145能够作为抑癌基因促进癌细胞凋亡, 为肝细胞癌的治疗提供了一条新的途径, 但是在肝细胞肝癌中miR-145异常低表达的机制尚不明确, 是否受DNA甲基化或(和)组蛋白甲基化的调控及HBV的影响将是我们下一步的研究方向.
人类许多肿瘤中都存在miRNA的异常表达, 异常表达的miRNA通过类似于癌基因/抑癌基因功能调控着肝癌的发生发展. 有报道P53通过诱导miR-145抑制c-Myc的表达, 但miR-145在肝癌中的表达水平以及其与c-Myc之间的关系还未见报道. c-Myc是肝癌发生进展中的关键癌基因, 因而探讨肝癌中miR-145和c-Myc的关系具有重要的价值.
荚卫东, 教授, 安徽省立医院肝胆外科
现在关于miRNA的研究主要集中在miRNA在肿瘤的发生发展中与癌基因/抑癌基因的相互作用及miRNA本身变化对其他基因的影响.
Chang等在此研究的基础上发现在B细胞淋巴瘤中有超过10种miRNA的表达受c-Myc的调控, 染色体免疫共沉淀研究证实c-Myc能与miRNA的上游保守序列或启动子序列特异性结合, 抑制miRNA的表达促进肿瘤的发展. 因此c-Myc的异常表达与肿瘤有密切的关系.
在结肠癌和乳腺癌中曾有报道c-Myc是miR-145的直接作用靶点, 且P53通过诱导miR-145表达能调控c-Myc的表达. 但在肝癌中miR-145与肝细胞癌之间类似的关系尚未见报道, 是否miR-145同样反向调控c-Myc的表达尚未见报道.
本文的研究证实了在肝癌中miR-145与c-Myc的关系, miR-145能够作为抑癌基因促进癌细胞凋亡, 为肝细胞癌的治疗提供了一条新的途径.
本文选题新颖, 有一定的科学价值.
编辑:李薇 电编:李薇
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