丹参酮ⅡA对人胰腺癌细胞凋亡的诱导作用及其对SAPK/JNK信号转导通路的影响

摘要

目的: 研究丹参酮ⅡA诱导人胰腺癌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的JNK信号转导通路, 揭示其抗胰腺癌的部分机制.

方法: MTT法观察丹参酮ⅡA对人胰腺癌PANC-1细胞的生长抑制作用; 8、16、32 mg/L丹参酮ⅡA分别作用人胰腺癌PANC-1细胞48 h后, 免疫荧光染色观察细胞凋亡情况; 流式细胞仪法(FCM)检测细胞凋亡; Western blot检测丹参酮ⅡA作用PANC-1细胞后SAPK/JNK信号通路的激活情况, 荧光定量PCR检测Survivin基因mRNA的表达水平; 并比较阻断JNK信号通路后, 丹参酮ⅡA对胰腺癌细胞凋亡Survivin基因mRNA的表达.

结果: MTT法测得丹参酮ⅡA对人胰腺癌PANC-1细胞的生长抑制率均有显著的抑制作用, 其作用与剂量和作用时间成正相关; 丹参酮ⅡA作用48 h后, 荧光显微镜下观察到经Hoechst染色的典型凋亡细胞. 8、16、32 mg/L浓度丹参酮ⅡA作用人胰腺癌细胞后的细胞凋亡率分别为8.83%±1.51%, 12.86%±2.70%和21.24%±2.58%, 与对照组(0.63%±0.18%)比较, 均有显著性差异(均P<0.01); 阻断JNK信号通路后, 凋亡率明显降低(P<0.01). 丹参酮ⅡA作用人胰腺癌细胞1 h后JNK信号通路被激活, 4 h达峰值. 16 mg/L丹参酮ⅡA作用人胰腺癌细胞48 h后, Survivin mRNA的表达明显下降, 分别为正常细胞的0.61, 0.39, 0.10倍; 阻断JNK信号通路后, 丹参酮ⅡA作用人胰腺癌细胞的Survivin mRNA的表达明显上升.

结论: 丹参酮ⅡA能诱导人胰腺癌PANC-1细胞株凋亡. 通过JNK信号转导通路下调Survivin mRNA的表达可能是其诱导胰腺癌细胞凋亡的重要机制.

关键词: 丹参酮ⅡA; 胰腺癌; 凋亡; SAPK/JNK; 信号转导; 生存素

Tanshinone IIA induces apoptosis of pancreatic cancer cells via the SAPK/JNK signal pathway

Yan Wang, Qi Li, Zhong-Ze Fan, Yi-Qin Wang, Yan-Yan Qiu, Bao-Hui Jin, Xing-Zhu Chen, Pei-Hao Yin

Yan Wang, Qi Li, Zhong-Ze Fan, Bao-Hui Jin, Xing-Zhu Chen, Department of Oncology, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China

Yi-Qin Wang, School of Basic Medical Sciences, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Pei-Hao Yin, Yan-Yan Qiu, Department of General Surgery, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 81001594; the Foundation of Shanghai Municipal Education Commission, No. 07cz014; the Foundation of Shanghai Municipal Science and Technology Commission, No. 09ZR1428500; and the Shanghai Leading Academic Discipline Project, No. S30302.

Correspondence to: Pei-Hao Yin, Department of General Surgery, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 164 Lanxi Road, Puto District, Shanghai 200062, China. yinpeihao1975@hotmail.com

Received: December 11, 2010
Revised: March 14, 2011
Accepted: March 23, 2011
Published online: April 8, 2011

Abstract

AIM: To investigate whether tanshinone IIA (TSIIA) induces apoptosis of human pancreatic cancer cells via the SAPK/JNK signal pathway.

METHODS: After treatment with TSIIA, MTT assay was used to observe the cytostatic effect of TSIIA on human pancreatic cancer PANC-1 cells; cell apoptosis was assessed by immunofluorescence and flow cytometry (FCM); p-JNK expression was assayed by Western blot; and mRNA expression of survivin was detected by quantitative fluorescence PCR.

RESULTS: TSIIA inhibited PANC-1 cell growth in a concentration- and time-dependent manner. After PANC-1 cells were treated with 8, 16, or 32 mg/L of TSIIA for 48 h, typical morphologic changes of apoptosis were observed by fluorescence microscopy after Hoechst staining. The apoptosis rates of cells treated with 8, 16, and 32 mg/L of TSIIA for 48 h were (8.83 ± 1.51)%, (12.86 ± 2.70)% and (21.24 ± 2.58)%, respectively, showing a significant difference among the three groups (P < 0.01). After the SAPK/JNK signal pathway was blocked, cell apoptosis rate decreased significantly (P < 0.01). p-JNK expression began to increase at 1 h and reached the peak at 4 h after TSIIA treatment. The mRNA expression of the survivin gene decreased obviously after treatment with 16 mg/L TSIIA for 48 h but increased significantly when the SAPK/JNK signal transduction pathway was blocked.

CONCLUSION: TSIIA can induce human pancreatic cancer cell apoptosis. TSIIA exerts anti-pancreatic cancer effects possibly by down-regulating the expression of survivin mRNA via the SAPK/JNK signal transduction pathway.

Key Words: Tanshinone IIA; Pancreatic cancer; Apoptosis; SAPK/JNK; Signal transduction; Survivin

0 引言

丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA, TSⅡA)为中药丹参主要有效成分之一, 最早用于治疗心脑血管疾病. 近年研究发现, TSⅡA对肝癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用, 引起了人们的广泛关注[1-3]. 国内外已有的研究[4-6]证实, TSⅡA能够诱导体外培养的细胞凋亡. 我们最近的实验研究也表明, TSⅡA能够显著地抑制小鼠胰腺癌瘤体生长, 延长生存期, 其抗胰腺癌的主要机制是诱导细胞凋亡[7,8]. 但其诱导细胞凋亡机制尚不明确. 本研究从细胞内信号转导角度对TSⅡA诱导人胰腺癌细胞株PANC-1细胞凋亡及凋亡相关基因进行研究, 探讨p38MAPK信号通路在TSⅡA诱导人胰腺癌细胞凋亡中的作用, 为揭示TSⅡA治疗胰腺癌的机制提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞株PANC-1购于中科院上海细胞研究所; TSⅡA购自西安冠宇生物技术有限公司, 纯度≥98%(批号: 200512001). JNK特异性的抑制剂sp600125购于美国Serologllcais公司; 总RNA抽提试剂RNAiso Reagent、荧光定量PCR试剂日本TaKaRa公司; GAPDH、Survivin上下游引物和探针由上海闪晶分子生物科技有限公司设计并合成, 5'端标记上报告荧光基团FAM(6-carboxy-fluo-rescein-phosphoramidite), 3'端标记上淬灭荧光基团TAMRA(carboxy-tetramethyl-rhodamine). 引物序列如下: 上游引物: 5'-GGTTCATCCAGTCGCTTTGT-3', 下游引物: 5'-AATTCTGTTGCCACCTTTCG-3'; 内参GAPDH作为对照, 上游引物: 5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3', 下游引物: 5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'. 氯仿、异丙醇、无水乙醇均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定TSⅡA对人胰腺癌细胞的生长抑制作用: 取对数生长期的人胰腺癌PANC-1细胞, 调整细胞浓度至2×10⁷/L, 以每孔100 μL接种于96孔培养板中, 在50 mL/L CO₂、饱和湿度、37 ℃孵箱中预培养24 h后加入100 μL不同浓度培养液配制的TSⅡA, 使最终每组含TSⅡA浓度分别为: 2、4、8、16、32、64 mg/L 6个剂量, 每个剂量分别设4个复孔, 并设正常细胞作对照组, 继续培养. 分别于24、48、72 h 3个时相进行MTT比色实验: 每次于实验结束前每孔加入浓度为5 g/L MTT液20 μL, 37 ℃避光培养继续培养4 h, 使MTT还原为formazan. 每孔加DMSO 150 μL, 震荡10 min, 混匀使formazan充分溶解, 10 min后置于酶标仪570 nm检测吸光度(A)值, 以空白组平均值调零, 按以下公式计算抑制率: 细胞生长抑制率 = (1-实验孔平均A值)/对照孔平均A值×100%, 以剂量和生长抑制率作直线相关分析.

1.2.2 Hoechst染色观察细胞凋亡形态: PANC-1细胞常规培养, 取对数生长期细胞制备细胞悬液, 以每孔1×10⁵个细胞接种于6孔培养板中, 在37 ℃、50 mL/L CO₂的培养箱中培养过夜. 加不同浓度TSⅡA (浓度为8、16、32 mg/L)作用48 h后, 按说明书固定、染色、封片. 荧光显微镜下激发波长350 nm, 发射波长460 nm观察.

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡: 人胰腺癌PANC-1细胞常规培养至对数生长期, 换无血清培养液培养12 h使细胞周期同步化, 设8、16、32 mg/L TSⅡA组, 20 μmol/L的JNK抑制剂sp600125组, 20 μmol/L的JNK抑制剂sp600125 TSⅡA组, 培养48 h后, 分别收集各组细胞置于10 mL离心管中. 各样本的细胞密度为1×109/L, 1 000 r/min离心5 min后弃去培养液. 用孵育缓冲液洗涤1次, 1 000 r/min离心5 min, 用100 μL标记溶液重悬细胞, 室温下避光孵育15 min, 1 000 r/min离心5 min沉淀细胞, 孵育缓冲液洗1次. 加入Annexin V-FITC /PI溶液5 μL, 4 ℃下孵育20 min. 最后补400 μL PBS, 用流式细胞仪(FACS Calibur, BD公司)检测细胞凋亡情况. 每个样品检测1万个细胞, 用Cell Quest软件分析细胞凋亡情况.

1.2.4 Western印迹法检测JNK的磷酸化: 将各组细胞用预冷的PBS液洗2次, 吸弃PBS液, 加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂, 轻轻摇动5 min后, 用一预冷的橡胶和塑料细胞刮刮下培养瓶壁上细胞, 转移细胞悬液到离心管中, 冰浴15 min进行裂解. 裂解液于预冷的离心机中14 000 r/min离心15 min, 吸弃上清液; BCA法测定蛋白质浓度. 50 μg总蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后, 电转移至PVDF膜, 膜在5% BSA溶液中室温培养1 h, 以封闭膜上的非特异结合. 封闭过的膜加入一抗4 ℃过夜. TBST洗膜3次, 每次5 min; 再加入HRP标记的二抗, 室温孵育1 h, TBST洗膜3次, 每次5 min; 同样方法标记鼠单克隆抗GAPDH作对照. 洗膜稍干后, 按1:1加入AB显影液(与二抗HRP结合), 在Bio-Rad的化学发光成像仪上显影, 然后分析灰度值, 再计算灰度系数比.

1.2.5 荧光定量PCR检测Survivin mRNA表达: 将TSⅡA稀释至终浓度为16 mg/L, 处理人胰腺癌细胞48 h后加胰酶消化离心收集细胞. 将各组细胞分别加入2 mL RNAiso, 按说明书提取总RNA, 1 μL总RNA在20 μL体系中按照标准程序进行反转录, 反应条件: 37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s. Survivin和GAPDH基因荧光定量PCR反应体系均如下: Premix EX TaqTM 10 μL, Rox Reference Dye 0.4 μL, 上下游引物各0.4 μL, 荧光探针0.8 μL, dH₂O 6 μL, cDNA 2 μL, 20 μL体系, 反应条件如下: (1)预变性: 95 ℃ 10 s; (2)变性: 95 ℃ 5 s; (3)退火, 延伸: 60 ℃ 31 s, 40个循环, 数据采用ABI 7300 SDS Software分析. 相对mRNA表达 = 2-ΔCt, ΔCt值 = 靶基因Ct值-GAPDH Ct值. 以GAPDH作为内参照, 同时以PANC-1细胞作为基准, 各组细胞mRNA的表达量表示成PANC-1细胞的N倍. N = 样品表达量/基准表达量 = 2-样本ΔCt/2-基准ΔCt, 每组均做3个样本, 取均数.

统计学处理 采用PEMS3.1医学统计软件包进行统计分析. 采用计量资料以mean±SD表示. 多样本比较采用单因素方差分析, Student's t, Rank sum test, SNK检验方法进行统计分析, 组间比较用t或t'检验. P<0.05具有统计学差异.

2 结果

2.1 TSⅡA对人胰腺癌细胞的生长抑制作用

不同剂量的TSⅡA在对PANC-1细胞的生长均有一定的抑制作用. 在相同的作用时间随着TSⅡA作用剂量的增加对PANC-1细胞的生长抑制率明显增高(P<0.01, 图1), 量效关系明显, 以下公式表明TSⅡA剂量与抑制率成正相关. TSⅡA剂量和对胰腺癌细胞的生长抑制率之间的直线回归方程为: 24 h: y = -0.0072x+0.8498, R² = 0.775; 48 h: y = -0.0074x+0.6822, R² = 0.7327; 72 h: y = -0.0062x+0.5218, R² = 0.9166. 72 h半数抑制浓度(IC₅₀)为3.52 mg/L(图2).

图1 TSⅡA对人胰腺癌PANC-1细胞生长的抑制作用.

图2 TSⅡA对PANC-1细胞生长抑制率与剂量的关系.

2.2 荧光显微镜观察细胞的形态学变化

荧光显微镜下对照组PANC-1细胞(未加药物处理)核呈弥漫均匀的蓝色荧光染色, 未见凋亡荧光染色细胞. 8、16、32 mg/L剂量的TSⅡA作用于人胰腺癌PANC-1细胞后, 均可见凋亡细胞, 表现为胞核或胞质内可见浓染致密的颗粒荧光及块状荧光(DNA荧光碎片, 图3).

图3 荧光显微镜细胞的形态学(Hoechst染色×200) A: 对照组; B: 8 mg/L TSⅡA组; C: 16 mg/L TSⅡA组; D: 32 mg/L TSⅡA组.

2.3 TSⅡA对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响

8、16、32 mg/L浓度的TSⅡA作用人胰腺癌细胞后的细胞凋亡率明显高于对照组的凋亡率(8.83%±1.51, 12.86±2.70%, 21.24±2.58% vs 0.63±0.18%), 并出现凋亡典型性特征峰. 加入抑制剂sp600125组的细胞凋亡率, TSⅡA组作用人胰腺癌细胞后凋亡率显著提高(0.78±0.09% vs 0.63±0.18%, P<0.01); 阻断SAPK/JNK信号转导通路后TSⅡA作用人胰腺癌细胞后凋亡率明显降低(P<0.01). 提示TSⅡA通过胰腺癌细胞内SAPK/JNK信号转导途径诱导细胞凋亡(图4).

图4 TSⅡA对胰腺癌细胞凋亡的影响. 1: 对照组; 2: JNK抑制剂组; 3: 8 mg/L TSⅡA组; 4: 16 mg/L TSⅡA组; 5: 32 mg/L TSⅡA组; 6: 16 mg/L TSⅡA+JNK抑制剂组. ^bP<0.01 vs 对照组.

2.5 TSⅡA对PANC-1细胞JNK的激活作用

对照组PANC-1细胞p-JNK弱表达, TSⅡA作用PANC-1细胞1 h时JNK被迅速激活, 随着作用时间的延长p-JNK表达逐步增强, 4 h达峰值, 约为对照组的 2.5倍(图5).

图5 TSⅡA对PANC-1细胞JNK的激活作用.

2.6 SAPK/JNK信号通路对TSⅡA诱导胰腺癌细胞凋亡Survivin mRNA的影响

TSⅡA作用人胰腺癌细胞48 h后Survivin mRNA的表达明显下调(P<0.01), 分别为正常细胞的0.61, 0.39, 0.10倍; 阻断SAPK/JNK信号通路后, Survivin mRNA的表达明显上调(P<0.01, 图6).

图6 TSⅡA诱导人胰腺癌细胞凋亡对Survivin mRNA的影响. 1: 对照组; 2: 8 mg/L TSⅡA组; 3: 16 mg/L TSⅡA组; 4: 32 mg/L TSⅡA组; 5: 16 mg/L TSⅡA+JNK抑制剂组. ^bP<0.01 vs 对照组.

3 讨论

胰腺癌属于中医中"癥瘕"、"积聚"等范畴. 近年来, 中医药治疗胰腺癌显现出一定的优势, 引起了人们关注, 现代研究发现[9-11], 中医药在胰腺癌治疗中具有在减轻症状、控制肿瘤发展、延长带瘤生存期等方面作用. 瘀血是肿瘤的常见中医症候, 活血化瘀是肿瘤的重要的中医治法之一. 中药丹参是活血化瘀的要药, 丹参酮是从中药丹参中提取的脂溶性有效成分, 按其不同的化学结构分为TanⅠA、TanⅡA、TanⅢB, 丹参酮Ⅳ等15种成分, 其中TSⅡA具有天然抗炎、抗氧化作用, 早年主要用于心脑血管病, 近年来研究发现对肝癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用, 其抗肿瘤的作用的通过诱导细胞凋亡途径的来实现[12,13]. 课题组前期实验研究也表明, TSⅡA能够显著地抑制小鼠胰腺癌瘤体生长, 延长生存期, 其抗胰腺癌的主要机制是诱导细胞凋亡.

细胞凋亡是在基因调控下的细胞程序性死亡, 临床上除了大剂量化疗、放疗可能引起细胞坏死外, 一般抗癌药物、激素制剂、放疗、中药等的主要作用机制之一, 都是通过诱导各自敏感的细胞发生凋亡来达到治疗目的. 凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡, 他在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视[14-16].

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)也被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK), 是丝裂原活化蛋白酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的重要成员, 是细胞内重要的信号转导通路之一[17-19]. JNK位于细胞质, 相对分子质量为54 000 Da的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶. JNK包含双磷酸化的功能区Thr-Pro-Tyr, JNK与其下游c-Jun N端的活化区结合并使其第63, 73位丝氨酸残基磷酸化, JNK的活化是通过其氨基酸残基端的磷酸化, 在静止细胞中, JNK通过磷酸化反应而激活, 一旦被激活, 胞质中的JNK移位到细胞核, 通过对转录因子c-Jun, ATF-2, Elk-1等的磷酸化促进基因的表达及新蛋白质的合成, 而促进或引起细胞凋亡[20]. 目前, 多数研究认为JNK通路是化疗药物, 紫外线照射及Fas蛋白等诱导细胞凋亡所必需的通路, 并必须持续激活JNK才能诱导细胞凋亡[21-23].

我们在实验中发现, TSⅡA对人胰腺癌PANC-1细胞的生长抑制率均有显著的抑制作用, 其作用与剂量和作用时间成正相关; TSⅡA作用48 h后, 荧光显微镜下观察到经Hoechst染色的典型凋亡细胞. 8、16、32 mg/L浓度TSⅡA作用人胰腺癌细胞后的细胞凋亡率分别为8.83%±1.51%, 12.86%±2.70%和21.24%±2.58%, 与对照组(0.63%±0.18%)比较, 均有显著性差异(P<0.01); 阻断JNK信号通路后, 凋亡率明显降低(P<0.01). TSⅡA作用人胰腺癌细胞1 h后, JNK信号通路被激活, 4 h达峰值. 16 mg/L TSⅡA作用人胰腺癌细胞48 h后, Survivin mRNA的表达明显下降; 阻断JNK信号通路后, TSⅡA作用人胰腺癌细胞的Survivin mRNA的表达明显上升. 提示TSⅡA治疗胰腺癌的机制与诱导胰腺癌细胞凋亡有关, 通过JNK信号转导下调Survivin mRNA是TSⅡA诱导胰腺癌细胞凋亡的重要机制之一. 本实验显示TSⅡA具有较好的诱导胰腺癌细胞凋亡的作用, 在治疗胰腺癌方面具有较好的应用前景.

评论

背景资料

丹参酮ⅡA是中药丹参的有效成分之一, 近年研究发现, 丹参酮ⅡA对胰腺癌等多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用, 已成为肿瘤治疗的一个新靶点.

同行评议者

杜群, 副研究员, 广州中医药大学脾胃研究所药理室; 张春虎, 副教授, 中南大学湘雅医院中西医结合研究所

研发前沿

随着分子生物学技术的发展, 信号转导及表达调控机制成为当今肿瘤研究中的热点. 如能从细胞内信号转导角度, 深入研究丹参酮ⅡA诱导胰腺癌细胞凋亡的机制, 将会为胰腺癌的治疗提供新的途径和实验方法.

相关报道

国内外有关报道提示丹参酮ⅡA对多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用. 国内已有的研究证明丹参酮ⅡA能够诱导体外培养的细胞凋亡, 但对丹参酮诱导胰腺癌细胞凋亡的具体机制尚缺乏报道.

创新盘点

本研究从细胞内信号转导角度揭示丹参酮ⅡA的抗胰腺癌机制, 并发现丹参酮ⅡA通过SAPK/JNK信号通路下调Survivin基因诱导胰腺癌细胞凋亡, 是其抗肿瘤的重要机制.

应用要点

本文研究了丹参酮ⅡA诱导人胰腺癌细胞凋亡的有效浓度和剂量关系, 探讨了治疗其作用的分子机制, 为丹参酮ⅡA治疗胰腺癌提供了理论依据.

同行评价

本文学术性较好, 揭示了丹参酮ⅡA诱导人胰腺癌细胞凋亡的部分机制.

备注

编辑: 李军亮 电编:何基才

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