基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-12-28; 18(36): 3843-3847
在线出版日期: 2010-12-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i36.3843
5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响
吴川清, 韩高雄, 帅晓明, 陶凯雄
吴川清, 韩高雄, 帅晓明, 陶凯雄, 华中科技大学同济医学院附属协和医院腔镜外科 湖北省武汉市 430022
吴川清, 在读硕士, 主要从事胃肠道肿瘤和先天性疾病方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30872473.
作者贡献分布: 此课题由陶凯雄设计; 研究过程由吴川清与韩高雄操作完成; 研究所用试剂及分析工具由陶凯雄提供; 数据分析由吴川清与帅晓明完成; 本论文写作由吴川清与陶凯雄完成.
通讯作者: 陶凯雄, 博士, 主任医师, 博士生导师, 430022, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属协和医院腔镜外科. kaixgtao@public.wh.hb.cn
电话: 027-85351619
收稿日期: 2010-09-27
修回日期: 2010-11-19
接受日期: 2010-11-23
在线出版日期: 2010-12-28

目的: 探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞株的生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响.

方法: 使用1、2、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR干预胃癌SGC-7901细胞, 甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测药物干预前后EDNRB基因的甲基化状态和EDNRB mRNA的表达, MTT法检测细胞增殖活性, 流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.

结果: 未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域CpG岛高甲基化, 且EDNRB mRNA不表达, 经1、2、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR处理4 d后, EDNRB基因启动子区域高甲基化状态得到逆转, 细胞中EDNRB mRNA表达恢复. 4种浓度5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞后, 细胞增殖受到抑制, 且呈时间和剂量依赖性; 并抑制SGC-7901细胞生长周期, 其细胞周期阻滞于S期, 5、10 μmol/L 5-Aza-CdR实验组细胞凋亡率显著高于对照组, 且差异有统计学意义(7.13%±0.87%, 13.34%±1.12% vs 3.69%±0.52%, P = 0.032, P<0.001).

结论: 5-Aza-CdR能有效逆转人胃癌SGC-7901细胞EDNRB基因的异常甲基化, 从而激活因高甲基化导致EDNRB基因沉默的再转录, 诱导该基因的表达, 抑制该细胞的生长.

关键词: 5-氮杂-2'-脱氧胞苷; 胃癌; 细胞株; 内皮素B受体; 基因; 甲基化
引文著录: 吴川清, 韩高雄, 帅晓明, 陶凯雄. 5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响. 世界华人消化杂志 2010; 18(36): 3843-3847
Treatment with 5-Aza-2'-deoxycytidine induces promoter demethylation of the EDNRB gene and inhibits cell proliferation in human gastric carcinoma cell line SGC-7901
Chuan-Qing Wu, Gao-Xiong Han, Xiao-Ming Shuai, Kai-Xiong Tao
Chuan-Qing Wu, Gao-Xiong Han, Xiao-Ming Shuai, Kai-Xiong Tao, Department of Laparoscopic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30872473.
Correspondence to: Professor Kai-Xiong Tao, Department of Laparoscopic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China. kaixgtao@public.wh.hb.cn
Received: September 27, 2010
Revised: November 19, 2010
Accepted: November 23, 2010
Published online: December 28, 2010

AIM: To investigate the effects of 5-Aza-2'-deoxycytidine on promoter hypermethylation of the EDNRB gene and cell proliferation in human gastric carcinoma cell line SGC-7901.

METHODS: After SGC-7901 cells were treated with different concentrations (1, 2, 5, 10 μmol/L) of 5-Aza-2'-deoxycytidine, the promoter methylation status of the EDNRB gene in SGC-7901 cells was analyzed using methylation-specific polymerase chain reaction (MSP); the expression of EDNRB gene in SGC-7901 cells was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR); cell proliferation was measured by MTT assay; and cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry.

RESULTS: Before treatment with 5-Aza-2'-deoxycytidine, promoter hypermethylation of the EDNRB gene was detected in SGC-7901 cells. Accordingly, the expression of EDNRB mRNA was not detected in SGC-7901 cells. After treatment of cells with 5-Aza-2'-deoxycytidine for four days, promoter demethylation of the EDNRB gene was induced and EDNRB mRNA expression was detected. Treatment with 5-Aza-2'-deoxycytidine restrained the proliferation of SGC-7901 cells in a time- and dose-dependent manner. Treatment with 5-Aza-CdR induced cell cycle arrest in S phase. The apoptosis rate was significantly higher in SGC-7901 cells treated with 5 or 10 μmol/L 5-Aza-CdR than in control cells (7.13% ± 0.87%, 13.34% ± 1.12% vs 3.69% ± 0.52%, both P < 0. 05).

CONCLUSION: 5-Aza-2'-deoxycytidine can effectively induce promoter demethylation of the EDNRB gene, activate EDNRB gene expression, and inhibit cell growth in human gastric carcinoma cell line SGC-7901.

Key Words: 5-Aza-2'-deoxycytidine; Gastric carcinoma; Cell line; Endothelin receptor B; Gene; Methylation
0 引言

随着表遗传学的发展, 人们认识到肿瘤不仅是遗传性疾病, 同时也是由DNA甲基化异常引起的基因调控失常的表遗传性疾病. 内皮素受体B(endothelin receptor B, EDNRB)基因是候选的抑癌基因之一, 其启动子异常高甲基化与多种肿瘤的发生发展相关[1], 但在胃癌组织中对该基因的研究, 目前尚未有报道. 5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)是一种DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)抑制剂, 通过抑制甲基化转移酶, 可使多种启动子区域高甲基化的抑癌基因重新表达或表达增高[2,3]. 为研究胃癌中EDNRB基因的甲基化状态及CpG岛去甲基化后其转录活性的表达, 我们应用5-Aza-CdR对SGC-7901细胞进行处理, 观察EDNRB基因的启动子甲基化状态、转录表达情况及细胞生物学特性的改变, 从而了解EDNRB基因启动子异常高甲基化与胃癌的关系, 并为胃癌的临床治疗提供新的靶点.

1 材料和方法
1.1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901由华中科技大学同济医学院附属协和医院腔镜外科腔镜实验室培养; RPMI 1640(Hyclone公司), 内含100 mL/L的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司); 琼脂糖(Invitrogen公司); 5-Aza-CdR(Sigma公司), 用PBS充分溶解后配制成1 mol/L的母液, -20 ℃保存; DNA提取试剂盒(QIAGEN公司); EZ DNA Methylation-Gold Kit(TIANGEN公司); AMV第1链cDNA试剂盒及PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司); TRIzol试剂(Invitrogen公司); 引物合成(Invitrogen公司); MTT及PI(BD公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和干预: 将SGC-7901细胞用含有100 mL/L的胎牛血清的RPMI 1640培养液中, 在50 mL/L CO2、37 ℃的培养箱中培养. 另配制含1, 2, 5, 10 μmol/L 5-Aza-CdR的完全培养液. 取传代后24 h的细胞, 分别加入1、2、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR浓度的完全培养液, 上述完全培养液每24 h更换1次, 培养4 d后回收细胞. 对照组则使用不含5-Aza-CdR的普通完全培养液.

1.2.2 MSP法检测5-Aza-CdR处理前后SGC-7901细胞中EDNRB基因甲基化状态: 取对照组和药物处理4 d后SGC-7901细胞, 用DNA提取试剂盒抽提细胞基因组DNA, 紫外分光光度计检测DNA纯度及含量. 每份标本取1 μg DNA, 参照EZ DNA Methylation-Gold Kit说明书对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰. 以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板, 使用甲基化扩增试剂盒分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增, 所有PCR扩增均使用25 μL反应体系. 引物参考文献[4], 扩增片段为121 bp, PCR反应条件: 95 ℃预变性10 min; 95 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环后; 72 ℃延伸10 min. PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳, 成像观察甲基化与非甲基化产物条带.

1.2.3 RT-PCR检测5-Aza-CdR处理前后SGC-7901细胞中EDNRB基因的表达: 取对照组和药物处理4 d后的SGC-7901细胞, 按RNA提取试剂盒说明书中步骤提取RNA后制备cDNA模板, 反应体系包括: 2.5 μg RNA, 1 μL dNTP, 2 μL二硫苏糖醇, 5×逆转录缓冲液4 μL, 1 μL寡聚脱氧胸苷酸(Oligo dT), 1 μL核糖核酸酶抑制剂(RNaseOUT), 1 μL莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus, MMLV)逆转录酶. 反应条件: 65 ℃ 5 min, 冰上冷却5 min; 37 ℃ 50 min, 70 ℃ 15 min. RT-PCR扩增: 反应体系中包含cDNA模板1 μL(100 ng). 预变性95 ℃ 10 min, 55 ℃退火30 s, 循环40次, 72 ℃延伸10 min. 引物序列参考文献[5], 产物长度为720 bp. 产物用2%琼脂糖凝胶电泳, 成像观察到目的条带则定义为EDNRB基因mRNA的阳性表达.

1.2.4 MTT法检测5-Aza-CdR作用于SGC-7901细胞后对细胞增殖的影响: 取对数生长期后成规消化, 按每孔3×103个/L种入96孔板, 100 μL/孔, 实验组5-Aza-CdR的终浓度分别为1, 2, 5, 10 μmol/L, 每组设3个复孔, 对照组加等量PBS, 共接种5板, 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL, 37 ℃孵育4 h后弃去上清液, PBS洗涤2次, 每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL, 置摇床振荡10 min后, 酶标仪上测定各孔A490孔值, 计算细胞增殖抑制率(CPTR), CPIR = (对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%; 并以A490值为纵坐标, 时间(d)为横坐标绘制细胞生长曲线.

1.2.5 流式细胞仪检测SGC-7901细胞周期与凋亡的影响: 取对照组和5-Aza-CdR干预4 d后SGC-7901细胞, PBS洗涤2次, 将细胞密度调整为1×109/L, 700 mL/L预冷的乙醇-20 ℃固定24 h以上, 加入RNase A至终浓度为0.1 g/L, 37 ℃温育30 min, 加PI至终浓度为50 mg/L, 室温避光染色30 min后, 用FACS流式细胞仪测定. 数据采用Modifit软件分析. 每组实验设定设定5个复孔, 重复3次.

统计学处理 SPSS17.0统计软件包处理数据, 实验数据以mean±SD表示, 多个样本均数间的两两分析采用LSD-t检验, 两组均数比较采用t检验, P<0.05差异有统计学意义, P<0.01差异有显著统计学意义.

2 结果
2.1 SGC-7901细胞EDNRB基因启动子区甲基化状态分析

用EDNRB基因甲基化特异性引物扩增出现预期条带, 扩增产物大小为121 bp, 而未甲基化引物未扩增出相应条带(图1).

图1
图1 SGC-7901细胞EDNRB基因启动子区甲基化状态分析. Marker: DL 1 000TM DNA Marker; M: 甲基化; U: 非甲基化; 2: 1的重复组.
2.2 经5-Aza-CdR处理SGC-7901细胞后EDNRB基因甲基化状态的改变

经4种浓度5-Aza-CdR分别处理后, 出现了杂合状态, 甲基化和非甲基化引物均扩增出产物, 说明甲基化和非甲基化的DNA序列均存在, 表明EDNRB基因启动子区域高甲基化发生了逆转(图2).

图2
图2 经5-Aza-CdR处理SGC-7901细胞后EDNRB基因甲基化状态的改变. Marker: DL 1 000TM DNA Marker; M: 甲基化; U: 非甲基化; 0: 对照组(未用药处理); 1-4: 1, 2, 5, 10 μmol/L 5-Aza-CdR.
2.3 5-Aza-CdR对SGC-7901细胞中EDNRB基因mRNA表达的影响

未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中未检测出EDNRB mRNA的表达, 4种不同5-Aza-CdR处理组中均检测出EDNRB mRNA表达, 并随着浓度的增高其表达增强(图3).

图3
图3 经5-Aza-CdR处理SGC-7901细胞后EDNRB基因mRNA表达变化. Marker: DL 1 000TM DNA Marker; M: 甲基化; U: 非甲基化; 0: 对照组(未用药处理); 1-4: 1, 2, 5, 10 μmol/L 5-Aza-CdR.
2.4 5-Aza-CdR对SGC-7901细胞增殖活性的影响

经4种不同浓度5-Aza-CdR作用后, SGC-7901细胞的生长增殖活性均有明显抑制, 与对照组比较, 细胞增殖速度出现不同程度减慢(图4). 在一定范围内5-Aza-CdR浓度越高, 对SGC-7901细胞的抑制作用越明显. 与对照组相比, 差异有统计学意义(P<0.05).

图4
图4 经不同浓度5-Aza-CdR处理SGC-7901细胞的生长曲线.
2.5 5-Aza-CdR对SGC-7901细胞周期和凋亡率的影响

经4种不同浓度5-Aza-CdR作用4 d后, 流式细胞仪分析细胞周期结果显示: 5、10 μmol/L 5-Aza-CdR实验组S期细胞数目增多, G0/G1期细胞减少, 细胞凋亡率显著增高(表1), 说明细胞周期阻滞于S期.

表1 5-Aza-CdR作用SGC-7901细胞4d后细胞周期与凋亡率的变化 (%, n = 4, mean±SD).
5-Aza-CdR浓度(μmol/L)G0/G1期S期G0/M期凋亡率
053.12±1.6939.43±2.149.45±0.963.69±0.52
151.25±2.6439.67±2.049.12±0.834.52±0.92
249.78±2.7741.74±1.968.89±1.064.88±1.21
546.70±1.37a44.77±2.40a8.12±0.987.13±0.87a
1046.14±1.82a45.67±2.17a8.02±0.7313.34±1.12b
aP<0.05,
bP<0.01 vs 对照组((0 μmol/L 5-Aza-CdR)).
3 讨论

EDNRB基因位于13号染色体q22, 长度大约为24 kb, 含7个外显子和6个内含子, 其编码产物EDNRB属于G蛋白偶联受体超家族, 与配体内皮素(endothelin, ET)结合传递细胞外的信号, 在胚胎发育过程中, EDNRB/ET-3在神经嵴细胞迁移发育分化成神经节细胞时候扮演着重要角色[6-10], 与巨结肠病相关联[11-14]. 有研究[15-25]显示, 在前列腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌、白血病、卵巢癌、恶性黑色素瘤、膀胱癌、子宫内膜癌及肾癌中均有存在EDNRB基因启动子异常高甲基化, 其中前列腺癌、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌和食管癌细胞株中经5-Aza-CdR处理后EDNRB基因重新表达.

甲基化改变不像基因突变和缺失等改变, 具有可逆性[26,27]. DNA甲基化的可逆性特征为临床抗肿瘤治疗提供了一种新途径: 应用DNMT抑制剂可以使一些重要基因发生去甲基化, 恢复正常功能. 5-Aza-CdR是第1个被美国FDA批准上市治疗恶性肿瘤的去甲基化药物[2,3]. 目前, 5-Aza-CdR已成功应用于临床的一些实例, 如在急性粒细胞白血病中的应用[28].

我们的研究结果表明, 未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域显示为高甲基化状态, 同时SGC-7901细胞中EDNRB基因mRNA不表达; 经5-Aza-CdR处理后, EDNRB基因的启动子区域高甲基化状态得到逆转, 并可检出EDNRB基因mRNA重新表达, 并且EDNRB基因mRNA的表达水平与药物作用浓度存在一定的正相关. 5-Aza-CdR干预SGC-7901细胞后, 细胞增殖速度减慢, 在一定范围内其抑制SGC-7901细胞增殖的作用呈量效关系, 并使细胞生长停滞在S期, 凋亡率显著升高. 由此可见, EDNRB mRNA表达失活与其基因启动子区域CpG岛高甲基化高度相关, 由于EDNRB基因启动子区域高甲基化而导致其表达失活, EDNRB基因的表达可通过5-Aza-CdR的去甲基化作用而被重新激活, 使其转录活性得到恢复, 从而使EDNRB基因再次发挥肿瘤抑制作用; 另外也说明5-Aza-CdR对SGC-7901细胞有显著的抑制增殖和诱导凋亡的作用, 并在一定程度上呈浓度依赖性, 究其原因, 5-Aza-CdR的去甲基化功能能诱发因高甲基化而封闭的基因重获表达, 通过逆转包括EDNRB基因在内的具有生长调控作用的基因启动子区域的高甲基化的状态, 使这些基因重新获得表达, 从而发挥抑制胃癌细胞生长及促进胃癌细胞凋亡的作用.

我们认为EDNRB基因在胃癌细胞中表达失活与该基因启动子区域CpG岛高甲基化高度相关, 而5-Aza-CdR能够逆转其启动子区域高甲基化状态并恢复EDNRB基因的表达, 使其再次发挥抑癌基因作用, 为胃癌的早期诊断和临床治疗提供了一种新的依据. 对该领域的进一步探讨有利于阐明胃癌发生发展的分子机制, 可能成为胃癌治疗新靶点.

评论
背景资料

胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位, 目前资料表明胃癌的癌变是一个多因素、多步骤、多阶段发展过程, 涉及癌基因、抑癌基因等的改变. EDNRB基因作为一种抑癌基因, 其启动子高甲基化可能在胃癌的发生发展中有着重要作用. DNA甲基化的可逆性特征可能为临床治疗胃癌提供了一种新途径, 应用DNA甲基转移酶抑制剂可以使EDNRB基因发生去甲基化, 恢复正常功能.

同行评议者

郑鹏远, 教授, 郑州大学第二附属医院消化科

创新盘点

本文首次报道了5-Aza-CdR能有效逆转人胃癌SGC-7901细胞EDNRB基因的异常甲基化, 从而激活因高甲基化导致EDNRB基因沉默的再转录, 诱导该基因的表达, 抑制该细胞的生长.

应用要点

EDNRB基因可能成为胃癌早期诊断的分子标志物, 同时由于DNA甲基化具有可逆性, 也可为胃癌提供新的治疗靶点.

同行评价

本文设计合理, 具有一定的理论意义和潜在的实用价值.

编辑:李薇 电编:何基才

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