修回日期: 2010-10-25
接受日期: 2010-11-02
在线出版日期: 2010-12-08
目的: 探讨钴原卟啉(cobalt protoporphyrin, CoPP)对急性胰腺炎的抑制作用及其机制.
方法: 将90只SD大鼠随机分为假手术组(SO组)、胰腺炎组(AP组)和应用CoPP组(CoPP组). 各组大鼠手术后6、12、24 h处死, 光镜下观察胰腺病理改变, 测定血清淀粉酶水平, ELISA方法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6), 实时定量PCR检测外周血单核细胞(PBMC)和胰腺组织中血红素氧合酶-1(HO-1) mRNA的表达.
结果: 与SO组相比, AP组和CoPP组在各时间点上胰腺组织水肿、炎性细胞浸润并伴有出血坏死等改变, 胰腺组织病理评分均明显上升(24 h: 9.13±1.02, 9.42±0.87 vs 0.00±0.00, 均P<0.01); 血清淀粉酶、TNF-α、IL-6水平均明显升高(24 h: 8 991.7 U/L±911.54 U/L, 8 298.0 U/L±1 015.67 U/L vs 819.1 U/L±177.81 U/L; 157.84 ng/L±19.72 ng/L, 142.09 ng/L±22.6 ng/L vs 25.71 ng/L±0.84 ng/L; 552.92 ng/L±72.96 ng/L, 511.03 ng/L±57.76 ng/L vs 89.51 ng/L±14.73 ng/L, 均P<0.01). 经CoPP诱导后显著促进了PBMC及胰腺组织的HO-1 mRNA表达(24 h: 2.795±0.282, 5.174±0.631 vs 0.780±0.105; 16.436±2.219, 28.902±3.791 vs 5.604±0.988, 均P<0.05). CoPP组早期(术后6、12 h)的胰腺组织病理评分、血清淀粉酶、TNF-α、IL-6水平较AP组明显下降(t = 5.08, 3.74; t = 4.38, 5.32; t = 6.19, 5.03; t = 4.92, 3.65, 均P<0.01).
结论: 急性胰腺炎早、中期应用HO-1诱导剂CoPP可抑制炎症反应发挥减轻胰腺损伤的作用, 这与其上调HO-1 mRNA的表达, 从而抑制细胞因子的产生密切相关.
引文著录: 郑立君, 彭上晋, 房林, 李晴, 丁卫星. 钴原卟啉对大鼠急性胰腺炎的抑制作用及其机制. 世界华人消化杂志 2010; 18(34): 3685-3689
Revised: October 25, 2010
Accepted: November 2, 2010
Published online: December 8, 2010
AIM: To investigate the protective effect of cobalt protoporphyrin (CoPP) against acute pancreatitis (AP) in rats and to explore possible mechanisms involved.
METHODS: Ninety Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups (n = 30 for each group): sham operation (SO) group, AP group, CoPP group. At 6, 12, and 24 h after AP induction, pancreatic pathological changes and serum levels of amylase, tumor necrosis factor-α (TNF-α), and interleukin-6 (IL-6) were detected and compared among different groups. The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PMBCs) and pancreatic tissue were measured by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
RESULTS: At 6, 12, and 24 h after the surgical procedure, rats of the AP and CoPP groups showed typical histopathological changes of AP. The pathological score of pancreatic tissue (24 h: 9.13 ± 1.02, 9.42 ± 0.87 vs 0.00 ± 0.00, both P < 0.01) and serum levels of serum amylase, TNF-α, and IL-6 (24 h: 8 991.7 U/L ± 911.54 U/L, 8 298.0 U/L ± 1 015.67 U/L vs 819.1 U/L ± 177.81 U/L; 157.84 ng/L ± 19.72 ng/L, 142.09 ng/L ± 22.6 ng/L vs 25.71 ng/L ± 0.84 ng/L; 552.92 ng/L ± 72.96 ng/L, 511.03 ng/L ± 57.76 ng/L vs 89.51 ng/L ± 14.73 ng/L, all P < 0.01) in the AP and CoPP groups were significantly elevated compared with the SO group. Pretreatment with CoPP up-regulated the expression of HO-1 mRNA in PBMCs and pancreatic tissue (24 h: 2.795 ± 0.282, 5.174 ± 0.631 vs 0.780 ± 0.105; 16.436 ± 2.219, 28.902 ± 3.791 vs 5.604 ± 0.988, all P < 0.05). Compared with the AP group, at 6 and 12 h after AP induction, the CoPP group had significantly alleviated pathological alterations, and lower pathological score, serum levels of amylase, TNF-α and IL-6 (t = 5.08, 3.74; t = 4.38, 5.32; t = 6.19, 5.03; t = 4.92, 3.65, all P < 0.01).
CONCLUSION: Pretreatment with CoPP can modulate inflammatory reaction and decrease pancreatic injury in AP rats via mechanisms that may be closely related to up-regulation of HO-1 expression to inhibit cytokine production.
- Citation: Zheng LJ, Peng SJ, Fang L, Li Q, Ding WX. Pretreatment with cobalt protoporphyrin protects against acute pancreatitis in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(34): 3685-3689
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i34/3685.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i34.3685
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是危害人类健康的常见疾病之一, 其病理过程中全身性炎症反应明显, 对重要器官损害严重, 死亡率高. 血红素氧合酶-1(heme oxygenase, HO-1)具有很强的抗炎和抗氧化作用, 是一种新的保护因子. 本实验通过观察HO-1诱导剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin, CoPP)对AP大鼠模型的治疗效果及对HO-1 mRNA表达的影响, 从而探讨CoPP对AP的抑制作用及其机制, 为CoPP用于临床治疗AP提供实验依据.
牛黄胆酸钠、CoPP(Sigma公司); RNeasy Protest Midi Kit(QIAGEN 公司)SYBR®Premix Ex TaqTM、PrimeScriptTM RT reagent Kit、6×Loding Buffer[宝生物工程(大连)有限公司]; TRIzol(Invitrogen公司); 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA试剂盒(美国Endogen公司). 90只SD♂大鼠(复旦大学科研动物中心提供), 清洁级, 体质量200-250 g.
1.2.1 实验设计与分组: 采用抽签法随机分为以下各组: 假手术组(SO组)、胰腺炎组(AP组)、应用CoPP组(CoPP组), 每组30只大鼠. SO组仅打开腹腔翻动胰腺组织即行关腹; AP组及CoPP组大鼠胰胆管逆行注入4%牛黄胆酸钠造模; AP组大鼠造模术前12 h给予腹腔注射生理盐水1 mL, CoPP组大鼠造模术前24 h给予该组大鼠腹腔注射钴原卟啉5 mg/kg(使用0.1 mol/L NaOH溶液溶解CoPP, 并稀释至实验所需浓度1.25 g/L).
1.2.2 造模及标本采集: 所有大鼠均于术前12 h禁食, 自由饮水. 用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg, 腹腔注射)麻醉, 固定, 去毛, 用75%酒精局部消毒, 腹壁正中切口进腹, 牵出十二指肠, 暴露胆总管, 可见胆总管两侧散在的胰腺组织, 在十二指肠乳头对侧肠壁上以外径0.75 mm BD针经胰胆管十二指肠乳头开口, 插入胰胆管5 mm, (成功置管后拔去针芯即可见黄色胆汁流出), 随后在胰胆管出肝门处用无损伤动脉夹夹闭, 防止药物反流入肝脏. 左手紧捏住BD留置针胰胆管内段, 防止药物流入十二指肠, 逆行注入4%牛黄胆酸钠1 mL/kg, 0.25 mL/min, 1-2 min后即可见胰腺充血、水肿, 胰胆管及主胰管扩张, 遂关腹. SO组、AP组和CoPP组于术后6、12、24 h在2%戊巴比妥钠麻醉下打开腹腔, 使用真空采血管下腔静脉采血. 常规分离血清及外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 用于血清淀粉酶、IL-6和TNF-α水平的测定及PBMC中HO-1 mRNA的表达. 处死动物后留取胰腺组织4块, 用于病理切片及检测胰腺组织HO-1 mRNA的表达.
1.2.3 病理观察及评分: 胰腺组织标本固定于4%多聚甲醛溶液中, 常规脱水, 石蜡包埋切片后行HE染色. 采用改良GREWAL法[1]对胰腺炎组织进行双盲法胰腺组织病理评分.
1.2.4 血淀粉酶的检测: 采用罗氏MODULAR全自动生化分析仪检测(糖底物法).
1.2.5 血清TNF-α、IL-6的检测: 按照ELISA试剂盒说明书进行定量测定.
1.2.6 实时定量PCR检测HO-1 mRNA的表达: 采用QIAGEN RNA抽提试剂盒RNeasy Protest Midi Kit, 按照试剂盒操作从胰腺组织、PBMC中抽提RNA. 经定量后以PrimeScriptTM RT reagent Kit将RNA逆转录为cDNA保存. 实时定量PCR引物设计为S(正义)链: 5'-TGCTCGCATGAACACTCTG-3', AS(反义)链: 5'-TCCTCTGTCAGCAGTGCCT-3'; 采用β-actin作为内参照物S(正义)链: 5'-TTACTGCCCTGGCTCCTA-3', AS(反义)链: 5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3'. 反应体系如下: cDNA 1.0 μL, 引物2.0 μL, SYBR®Premix Ex TaqTM 12.5 μL, 无RNA水9.5 μL, 总反应体积为25 μL. 反应条件为95 ℃预变性10 s; 然后进行2步PCR反应: 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 20 s, 共45个循环. 数据由GenAmp®PCR System 2700进行收集及分析. 采用比较Ct法(ΔΔCt法)进行胰腺组织及PBMC中HO-1 mRNA表达的定量分析. 系统分析检测每一反应管的扩增曲线(荧光强度曲线), 该曲线反映所有标本不同循环的荧光强度, 系统同时计算出反应体系中检测样本中β-actin(内参基因)及HO-1基因的Ct值. ΔCt = Ct目的基因-Ct内参基因; ΔΔCt = ΔCtHO-1-ΔCt参照因子. 用2-ΔΔCt表示HO-1 mRNA的相对表达量.
统计学处理 应用SPSS10.0统计学软件处理数据, 计量数据以mean±SD表示, 两组之间比较采用t检验, 3组之间比较选用单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义.
SO组大鼠各时间点胰腺组织在光镜下腺体小叶结构完整, 间质无异常; AP组及CoPP组在术后6 h即可见胰腺腺泡肿胀, 间质水肿, 小叶分离, 有炎性细胞浸润; 术后12 h及24 h 两组大鼠胰腺腺泡充血水肿更加明显, 间质可及水肿出血, 炎性细胞浸润明显多于术后6 h. 经GREWAL评分发现SO组各时间点病理评分皆为0, 同时间点AP组和CoPP组的胰腺组织病理评分均高于SO组(t = 46.15, 44.75, 28.31; t = 33.88, 18.74, 31.94, 均P<0.01); CoPP组在术后6 h、12 h的病理评分较AP组有明显降低(t = 5.08, 3.74, 均P<0.01, 表1).
AP组及CoPP组在各时间点血清淀粉酶水平相对SO组均有升高(t = 21.55, 20.71, 27.83; t = 30.28, 34.75, 22.94, 均P<0.01). CoPP组在术后6、12 h的血清淀粉酶水平较AP组有所降低(t = 4.38, 5.32, 均P<0.01). SO组、AP组术后各时间点间血清淀粉酶水平无明显差别(F = 1.2256, 1.4416, 均P>0.05). CoPP组术后血清淀粉酶水平呈先下降后升高的趋势. 术后12 h血清淀粉酶含量最低(F = 17.1854; P<0.01, 表2).
AP组和CoPP组术后各时间点血清TNF-α、IL-6水平明显高于SO组(AP组 vs SO组: t= 20.06, 12.99, 21.17; t = 22.80, 27.07, 19.69, 均P<0.01; CoPP组 vs SO组: t = 18.77, 18.84, 16.27; t = 19.41, 20.86, 22.36, 均P<0.01). 在术后6、12 h CoPP组血清TNF-α、IL-6水平明显低于AP组(TNF-α: t = 6.19, 5.03, 均P<0.01; IL-6: t = 4.92, 3.65, 均P<0.01). SO组各时间点间TNF-α、IL-6的表达无明显差异(F = 0.4429, 1.0278, 均P>0.05). AP组和CoPP组大鼠术后血清TNF-α的含量呈逐渐上升趋势, 其中术后24 h与术后6、12 h相比差异有统计学意义(F = 31.7449, 77.3101; P<0.01). AP组在术后各时间点间IL-6的血清水平无明显差异(F = 3.1545, 均P>0.05), 而CoPP组术后血清中IL-6的水平呈逐渐增高趋势, 其中术后24 h较术后6 h有明显升高(F = 25.4115; P<0.01, 表3).
AP组和CoPP组术后各时间点PBMC和胰腺组织中的HO-1 mRNA表达都明显高于SO组(AP组vs SO组: t = 5.997, 10.275, 10.774; t = 4.332, 5.215, 5.902, 均P<0.01; CoPP组 vs SO组: t = 10.556, 11.476, 8.502; t = 4.501, 6.493, 6.799, 均P<0.01). 经CoPP诱导后, CoPP组的HO-1mRNA表达在PBMC和胰腺组织中的表达均高于AP组(t = 2.705, 4.207, 4.344; t = 2.140, 2.648, 3.228, 均P<0.05). SO组各时间点间HO-1mRNA在PBMC及胰腺组织中的表达均无明显差别(F = 0.8519, 0.1693, 均P>0.05); 而AP组和CoPP组HO-1 mRNA随着时间的推移在PBMC和胰腺组织中的表达呈逐渐上升趋势(AP组: F = 4.5675, 3.8941; P<0.05; CoPP组: F = 14.3917, 6.0483; P<0.01, 表4).
| 分组 | PBMC | 胰腺组织 | ||||
| 6 h | 12 h | 24 h | 6 h | 12 h | 24 h | |
| SO组 | 0.841 ± 0.169 | 0.737 ± 0.075 | 0.780 ± 0.105 | 5.715 ± 1.002 | 5.464 ± 0.907 | 5.604 ± 0.988 |
| AP组 | 1.773 ± 0.278b | 2.330 ± 0.281b | 2.795 ± 0.282b | 9.493 ± 1.341b | 13.740 ± 1.936b | 16.436 ± 2.219b |
| CoPP组 | 2.614 ± 0.213bc | 3.531 ± 0.364bd | 5.174 ± 0.631bd | 15.538 ± 2.829bc | 21.407 ± 2.712bc | 28.902 ± 3.791bd |
AP是普外科最常见的急腹症之一. 在其发病过程中, 除有局部的病理损伤外, 全身性炎症反应是其主要的病理性改变. 近年来研究认为, 炎症介质的"瀑布样级联反应"是引起胰腺炎炎症扩布、病情加重、甚至多器官功能障碍以至死亡的主要原因[2]. AP时由于胰腺炎症和肠源性感染性因素使巨噬细胞激活, 合成和分泌大量细胞因子, 如TNF-α[3]、ILs[4]、血小板活化因子[5]、磷脂酶A2[6]、干扰素-γ[7]等. 这些炎症介质构成相互作用的网络并产生炎症级联放大效应, 从而使病情加重. 此外多种促炎细胞因子和炎症介质过度释放所导致的胰腺微循环障碍是近年来AP发病机制研究的另一重点[8]. 根据细胞因子的作用特点, 采取相应措施阻断细胞因子产生和释放, 是治疗胰腺炎的重要方法之一; 如能有效调节早期过度的炎症反应以及控制后续的感染及内毒素血症, 则可能对AP的预后产生重要影响.
血红素氧合酶(heme oxygenase, HO)具有较强的抗炎和抗氧化作用, 是一种新的保护因子. HO是亚铁血红素(hemin)分解代谢的限速酶, 报道最多且在炎症中发挥重要作用的是HO-1, 他是哺乳动物3种HO同工酶之一, 其表达的程度与炎症的发展密切相关[9]; 诱导HO-1能抑制炎症反应, 而抑制HO-1则促进炎症反应[10]; HO-1的高表达可保护心肌减轻由缺血/再灌注损伤、低氧、移植排斥所致的损伤[11]; 肝脏内HO-1的活化可减轻由于缺血/再灌注损伤、内毒素所致的微循环功能障碍和细胞损伤[12]; 大鼠炎症性肠病及小鼠结肠炎, 予HO-1抑制剂ZnPP后结肠损伤加重[13]. CoPP是公认的HO-1的激活物之一, 他可以在不同的器官组织内引起HO-1基因的持续高表达, 从而通过HO-1的抗炎活性发挥对炎症损伤的抑制作用[14].
在本实验中我们通过给予AP大鼠HO-1诱导剂CoPP后发现无论在PBMC还是在胰腺组织中HO-1 mRNA的表达随着时间的推移有明显增加, 并且发现CoPP组早期(术后6、12 h)的胰腺组织病理评分明显降低, 其血淀粉酶水平亦较AP组明显下降. 这表明CoPP通过上调HO-1表达而明显减轻胰腺炎症, 从而起到治疗胰腺炎的作用. HO-1抗炎机制目前仍未完全清楚, 可能与其作用产物CO、胆绿素和铁蛋白有关. HO-1的作用产物CO具有抗炎、抑制血小板聚集、活化铁通道、控制细胞增殖、抗凋亡及细胞保护等作用[14,15]. 研究表明, 予HO-1诱导剂CoPP诱导HO-1, 可减少内毒素所致的细胞因子表达, 并通过p38 MAPK和NF-κB等途径抑制相关因子如TNF-α、IL-1β和巨噬细胞抑制蛋白-1β等的合成[16]. 在本实验中我们发现给予AP大鼠模型CoPP后, 大鼠血中TNF-α、IL-6在术后早、中期较AP组有明显下降, 提示HO-1通过抑制IL-6、TNF-α等炎症介质的表达、释放从而达到保护大鼠胰腺损伤的作用. 但由于AP时炎症介质的释放、炎症反应的加重是由多途径、多因素调控的, 人为阻断其中一条途径并不能完全抑制炎症反应. 此外随着炎症反应的抑制, 机体免疫能力下降, 使得肠屏障功能下降后细菌移位所导致的内毒素血症加重, 从另一途径加重胰腺损伤[17]. 本实验在AP晚期(术后24 h)发现CoPP组与AP组在胰腺组织评分、血淀粉酶、血IL-6、血TNF-α等指标方面无明显差异可能与上述原因密切相关.
总之, AP早、中期应用HO-1诱导剂CoPP可抑制炎症反应, 发挥减轻胰腺损伤的抑制作用, 这与其上调HO-1 mRNA的表达, 从而抑制细胞因子的产生密切相关.
急性胰腺炎是一种临床上常见的急腹症, 其发病急、进展快、死亡率高. 近年来随着对全身炎症反应综合征的深入研究, "炎症介质学说"在其发病机制的研究中受到广泛关注. 通过各种方法阻断炎症介质的释放及其介导的炎症效应正成为治疗急性胰腺炎的新突破口.
谷俊朝, 主任医师, 首都医科大学附属北京友谊医院普外科
Ernst等在2008年的研究中证实了HO-1在胰腺缺血再灌注损伤后胰腺微循环的重建中发挥着重要的作用. 刘志勇等2009年的研究证明了血晶素通过上调机体HO-1 mRNA的表达, 从而减轻急性胰腺炎时肺组织的损伤.
本研究在建立大鼠急性胰腺炎模型的基础上, 观察HO-1诱导剂钴原卟啉(CoPP)在不同时间点对大鼠急性胰腺炎的治疗作用, 并采用实时定量PCR技术精确测定外周血单核细胞(PMBC)及胰腺组织中血红素氧合酶-1的表达, 从而阐明CoPP对急性胰腺炎的抑制作用及其机制.
本研究通过动物实验证实应用HO-1诱导剂CoPP可在急性胰腺炎早、中期抑制炎症反应, 发挥减轻胰腺损伤的作用; 并同时阐明了这一作用与其上调HO-1 mRNA的表达从而抑制促炎细胞因子的产生密切相关. 该结果为CoPP的临床应用提供了理论依据, 但其临床疗效仍需要进一步验证.
本文选题新颖, 实验设计合理, 能够反映我国胃肠病学基础研究的先进水平.
编辑:李薇 电编:李薇
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