缺血后处理在大鼠肝移植缺血再灌注损伤中的作用

摘要

目的: 探讨缺血后处理对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的作用.

方法: SD大鼠随机分成6组. (1)假手术组: 开腹后仅游离肝周韧带; (2)缺血再灌注组: 仅行大鼠原位肝移植术; (3)缺血后处理10 s/10 s组: 大鼠原位肝移植术后门静脉开放前行再灌注10 s/阻断10 s的缺血后处理; (4)缺血后处理30 s/30 s组: 后处理为再灌注30 s/阻断30 s; (5)缺血后处理60 s/60 s组: 后处理为再灌注60 s/阻断60 s; (6)缺血后处理90 s/90 s组: 后处理为再灌注90 s/阻断90 s. 后处理组再灌注/阻断6个循环后完全开放门静脉. 分别于门静脉恢复血流后2 h和6 h采集标本, 观察血清肝功能、肝组织病理改变、肝脏组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量, 此外, 还观察各组大鼠的存活率.

结果: 缺血后处理30 s/30 s和60 s/60 s组在术后2 h和6 h, 与缺血再灌注组相比肝功能明显改善, 肝脏组织病理形态学损伤明显减轻, 其中缺血后处理60 s/60 s组效果最佳, 其余后处理组对肝脏缺血再灌注损伤没有保护作用. 缺血后处理60 s/60 s组与缺血再灌注组相比, 术后6 h肝组织MDA水平明显降低(8.69 μmol/g±1.68 μmol/g vs 14.31 μmol/g±2.43 μmol/g, P = 0.0087), 而SOD活性则显著增高(10.01 UN/mg±0.89 UN/mg vs 6.92 UN/mg±1.19 UN/mg, P = 0.0092). 除假手术组外, 缺血后处理60 s/60 s组大鼠存活率明显高于其他组.

结论: 缺血后处理能减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤, 减轻肝组织氧化应激, 提高大鼠存活率, 其中以再灌注60 s/阻断60 s循环作用最佳.

关键词: 肝移植; 缺血后处理; 大鼠; 缺血再灌注损伤

Protective effects of ischemic postconditioning against ischemia/reperfusion injury in rats undergoing liver transplantation

Han-Fei Huang, Fei Song, Yu-Jun Zhang, Zhi-Yong Yu, Jian Duan, Wang-Gang Xu, Ming-Qing Chen, Zhong Zeng

Han-Fei Huang, Fei Song, Zhi-Yong Yu, Wang-Gang Xu, Ming-Qing Chen, Zhong Zeng, Jiang Duan, Organ Transplantation Center, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Yu-Jun Zhang, Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Supported by: the Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2007C137M; the Joint Fund of Yunnan Provincial Science and Technology Department, No. 2007C0009R; and the Social Development Project of Yunnan Province, No. 2008CA026.

Correspondence to: Associate Professor Zhong Zeng, Organ Transplantation Center, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, Yunnan Province, China. zzong@medmail.com.cn

Received: September 4, 2010
Revised: November 6, 2010
Accepted: November 10, 2010
Published online: December 8, 2010

Abstract

AIM: To explore whether ischemic postconditioning protects against ischemia/reperfusion injury in rats undergoing liver transplantation.

METHODS: Male Sprague-Dawley rats were divided randomly into six groups: animals undergoing sham operation (sham), ischemia/reperfusion (I/R), and ischemic postconditioning consisting of 6 cycles of 10 s/10 s (post-10 s), 30 s/30 s (post-30 s), 60 s/60 s (post-60 s) or 90 s/90 s (post-90 s) reperfusion/reocclusion. At 2 and 6 h after portal vein reperfusion, blood and liver tissue samples were taken to determine liver function, histopathology, and liver homogenate MDA and SOD levels. Moreover, the survival rate of rats was measured.

RESULTS: At 2 and 6 h after reperfusion, post-30 s and post-60 s reperfusion/reocclusion markedly improved liver function, ameliorated hepatocellular damage, lowered MDA level, and elevated SOD activity compared with the I/R group (8.69 μmol/g ± 1.68 μmol/g vs 14.31 μmol/g ± 2.43 μmol/g, P = 0.0087; 10.01 UN/mg ± 0.89 UN/mg vs 6.92 UN/mg ± 1.19 UN/mg, P = 0.0092). In contrast, post-10 s and post-90 s reperfusion/reocclusion failed to protect against liver damage. Excluding the sham-operated group, rat survival rate was significantly higher in the post-60 s group than in the other groups.

CONCLUSION: Ischemic postconditioning can reduce reperfusion injury, attenuate oxidative stress, and improve survival in rats undergoing liver transplantation. Ischemic postconditioning consisting of 6 cycles of 60 s/60 s reperfusion/reocclusion exhibits the best protective effects against ischemia/reperfusion injury in rats undergoing liver transplantation.

Key Words: Liver transplantation; Ischemic postconditioning; Rat; Ischemia/reperfusion injury

0 引言

自1963年Starzl等[1]施行首例临床肝移植手术以来, 肝移植已成为当今治疗终末期肝病的唯一有效方法. 然而, 同其他大器官移植一样, 供肝离体后的缺血再灌注损伤乃是临床医师面临的重大难题, 常导致手术后供肝原发性无功能, 被认为是肝移植失败的主要原因之一. 通过研究发现, 缺血预处理(ischemic preconditioning)对供肝的保存及缺血后再灌注损伤有一定的保护作用, 但由于组织器官的缺血具有不可预测性, 从而使缺血预处理的临床应用价值受限. 2003年, Zhao等[2]在心肌梗塞的研究中发现, 采用缺血后处理(ischemic postconditioning)能明显的减少心肌梗死面积, 减轻组织水肿及炎性细胞的聚集. 然而, 缺血后处理在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及机制仍不清楚, 现有文献报道的缺血后处理方式也有很大差异. 我们通过建立大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤模型, 研究不同的后处理方式对移植肝脏再灌注损伤的保护作用, 探讨其可能的作用机制, 为进一步研究奠定理论基础.

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级近交系健康♂SD大鼠, 体质量200-250 g, 由中国人民解放军第三军医大学附属大坪医院实验动物中心提供. 丙二醛(MDA)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

1.2 方法

1.2.1 实验设计与分组: 肝脏冷缺血再灌注损伤模型的建立参照Kamada等建立的大鼠"二袖套"肝移植模型, 供体术前不禁食, 受体和假手术组术前禁食24 h, 但不禁水, 手术后自由进食, 采用乙醚吸入麻醉, 供肝采用4 ℃的生理盐水保存90 min, 所有操作均由同一术者完成. 将264只♂SD大鼠随机分成6组, 假手术组为24只, 其余组供受体各24只. (1)假手术(Sham)组: 开腹后仅游离肝周韧带; (2)缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/R)组: 肝移植完成后直接开放门静脉; (3)缺血后处理10 s/10 s(Post-10 s)组: 肝移植完成后在完全开放门静脉前给予再灌注10 s/阻断10 s共6个循环的后处理; (4)缺血后处理30 s/30 s(Post-30 s)组: 按照再灌注30 s/阻断30 s共6个循环的后处理; (5)缺血后处理60 s/60 s(Post-60 s)组: 按照再灌注60 s/阻断60 s 6个循环的后处理; (6)缺血后处理90 s/90 s(Post-90 s)组: 按照再灌注90 s/阻断90 s 6个循环的后处理, 各组分别于门静脉恢复血流后2 h或6 h采集标本(每组各8只), 其余各组剩下8只观察其存活率.

1.2.2 肝功能的测定: 从腹主动脉采血并离心得到血清, 使用全自动生化分析仪检测ALT和AST.

1.2.3 肝脏组织病理形态学观察: 肝脏组织固定于40 g/L中性甲醛, 常规石蜡包埋, 3 μm连续切片, HE染色后在光镜下观察组织形态学改变.

1.2.4 肝组织MDA和SOD含量的测定: 切取新鲜的肝脏组织, 称取100 mg, 加入9倍的生理盐水制成10%组织匀浆, 3 000 r/min离心30 min, 取上清液检测MDA含量和SOD活性. 以硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量, 黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性, 蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定.

统计学处理 本实验所有数据在Windows XP操作系统下应用SPSS13.0统计软件包进行分析和检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 均数之间作进一步比较用q检验, 结果用mean±SD表示. 生存分析采用Kaplan-Meier法, 并进行Log-rank时序检验, 以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 肝功能的改变

I/R组与缺血后处理组术后2和6 h, 血清转氨酶ALT和AST明显增高, 与I/R组相比, Post-30 s和Post-60 s组, 血清ALT和AST水平明显降低, 差异有统计学意义(P<0.05), 且以Post-60 s组下降最明显. 而Post-10 s和Post-90 s组与I/R组相比, 差异无统计学意义(P>0.05, 图1).

图1 各组大鼠血清ALT、AST含量的变化. ^aP<0.05 vs I/R组.

2.2 肝脏组织病理学改变

假手术组肝小叶结构和肝细胞形态正常. I/R组、Post-10 s和Post-90 s组肝小叶结果紊乱, 肝血窦充血, 肝细胞肿胀、空泡状变性和点状坏死. 而Post-30 s和Post-60 s组肝脏充血明显减轻, 肝细胞形态轻度改变, 细胞变性不明显, 未见肝细胞坏死(图2).

图2 各组大鼠肝脏组织标本的病理形态学改变(HE×400). A: Sham组; B: I/R组; C: Post-10 s组; D: Post-30 s组; E: Post-60 s组; F: Post-90 s组.

2.3 肝组织MDA和SOD含量的变化

肝脏再灌注后肝组织MDA含量增高, 与I/R组相比, Post-30 s和Post-60 s组中肝脏组织MDA含量降低, 差异有统计学意义(P<0.05), 以Post-60 s组下降最明显, 而Post-10 s和Post-90 s组与I/R组之间相比无统计学意义(P>0.05, 图3). 与I/R组相比, Post-30 s和Post-60 s组中肝脏组织SOD活性增加, 差异有统计学意义(P<0.05), 而Post-10 s和Post-90 s组与I/R组之间相比无统计学意义(P>0.05, 图4).

图3 各组大鼠肝脏MDA含量的变化. ^aP<0.05 vs I/R组.

图4 各组大鼠肝脏SOD活性的变化. ^aP<0.05 vs I/R组.

2.4 大鼠存活率的影响

连续观察各组8只大鼠30 d, Post-60 s组大鼠在第30天仍有30%存活, 明显高于I/R组和其他缺血后处理组, 与I/R组比较差异显著(P = 0.005, 图5).

图5 各组大鼠的生存曲线. ^aP = 0.005 vs I/R组.

3 讨论

缺血预处理是指器官在经历缺血前经过短暂的缺血过程能增强随后对持续缺血的耐受性[3,4], 减轻缺血所带来的损伤, 尽管大量的研究表明缺血预处理能减轻器官的I/R, 但由于器官的缺血具有不可预测性, 应用于外科临床有很大的局限性, 从而使缺血后处理越来越受到人们的重视. 缺血后处理是指在再灌注早期给予反复短暂的"再灌注/阻断"(reperfusion/reocclusion)循环, 这种缺血后再灌注血流的动力学改变能减轻I/R[5-7].

缺血后处理保护器官I/R现象首先是在心肌缺血的研究中发现的, 目前主要的研究集中在心脏和大脑神经系统的I/R. 我们的研究表明缺血后处理能有效地减轻肝脏冷缺血再灌注损伤, 改善肝脏的氧化应激, 提高大鼠肝移植术后存活率, 保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤. Wang等[8]在对大脑神经系统的缺血后处理的研究中发现, 缺血后处理应用于不同种属和不同器官上需要不同的"再灌注/阻断"策略, 在本实验中, 我们设定了不同的"再灌注/阻断"时间, 探讨不同的缺血后处理策略对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的影响. Post-30 s和Post-60 s组在肝脏恢复门静脉血流前给予6个循环的"再灌注30 s/阻断30 s"或"再灌注60 s/阻断60 s"方案, 恢复全面灌注后6 h, 血清ALT、AST水平比I/R组明显降低, 肝脏组织MDA含量下降、抗氧化酶SOD活性增强以及组织病理损害减轻, 而Post-10 s和Post-90 s组不具有抗大鼠肝脏I/R作用, 提示以"再灌注30 s/阻断30 s"和"再灌注60 s/阻断60 s"这两种后处理方式对大鼠肝移植I/R有保护作用, 其中以"再灌注60 s/阻断60 s"方式效果最佳. 另外, 在观察各组大鼠肝移植后的存活率, 连续观察30 d, Post-60 s组在第30天仍有3只存活, 而I/R组已全部死亡, 表明缺血后处理能提高大鼠肝移植的存活率, 改善手术后恢复效果.

缺血后处理的作用机制目前仍不清楚, 我们通过研究发现不同的"再灌注/阻断"方式对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的作用不同, 仅以"再灌注30 s/阻断30 s"和"再灌注60 s/阻断60 s"这两种方式对大鼠移植肝有保护作用, 其中以"再灌注60 s/阻断60 s"的后处理方式最佳. 提示这两种后处理方式能保护大鼠肝移植I/R, 而实验中另外的两种后处理方式不能启动保护作用, 提示"再灌注/阻断"时间是缺血后处理的一个关键性因素, 时间太短或太长都不利于I/R的恢复, 只有恰当的"再灌注/阻断"时间才能发挥缺血后处理的保护作用. 在大鼠肝移植过程中, "再灌注30 s/阻断30 "和"再灌注60 s/阻断60 s"这两种后处理方式可能是发挥肝脏保护作用的一个触发点. Vinten-Johansen[9]认为, 缺血后处理仅在再灌注的前几分钟干涉才发挥效益, 在心肌保护作用的研究中认为, 后处理的保护作用是反复短暂的再灌注在组织器官恢复血流的最初2 min内, 对高碳酸血的缓冲作用[10], 表明维持再灌注最初2 min内组织酸中毒状态是缺血后处理的一个重要机制. 我们的研究发现Post-30 s和Post-60 s组对大鼠移植肝有明显的保护作用, 可能与他们能维持再灌注早期的组织酸中毒状态有关.

研究表明, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生过多或抗氧化酶活性下降导致氧化应激在I/R中发挥着重要的作用[11-13]. MDA是氧自由基攻击多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用而生成的脂质过氧化物, 检测MDA含量常可反映机体内脂质过氧化程度, 能较好的反映机体内氧自由基水平及脂质过氧化损伤程度. SOD是体内重要的抗氧化酶, 具有清除自由基的作用, 保护细胞不受氧自由基损伤[14,15]. 我们研究发现, Post-30 s和Post-60 s组肝组织MDA的含量降低, 而抗氧化酶SOD活性明显增加, 提示缺血后处理能够减轻再灌注后氧自由基的产生并提高肝脏的抗氧化能力. 以往的研究也表明缺血后处理保护心肌[12,16]和大脑神经系统[7]I/R的机制与减轻ROS的产生、减少炎性细胞的聚集有关, 与我们的研究结果相符, 表明缺血后处理在发挥保护大鼠移植肝I/R作用机制可能是降低了脂质过氧化和减少了ROS的产生.

总之, 缺血后处理能减轻肝脏冷I/R, 抑制氧自由基的过量产生, 提高肝脏抗氧化能力, 发挥保护作用. 缺血后处理操作方法简单, 可控性好, 效果确切, 具有很强的临床实用价值.

评论

背景资料

缺血后处理保护器官缺血再灌注损伤的现象首先是在心肌缺血的研究中被发现, 目前主要的研究集中在心脏和大脑神经系统, 缺血后处理在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及机制仍不清楚, 现有文献报道的缺血后处理方式也有很大差异.

同行评议者

李华, 副教授, 中山大学附属第三医院肝脏外科

研发前沿

1963年Starzl等施行首例临床肝移植手术以来, 肝移植已成为当今治疗终末期肝病的唯一有效方法. 然而, 同其他大器官移植一样, 供肝离体后的缺血再灌注损伤乃是临床医师面临的重大难题.

相关报道

Vinten-Johansen认为, 缺血后处理仅在再灌注的前几分钟干涉才发挥效益, 在心肌保护作用的研究中认为, 后处理的保护作用是反复短暂的再灌注在组织器官恢复血流的最初2 min内, 维持再灌注最初2 min内组织酸中毒状态是缺血后处理的一个重要机制.

创新盘点

根据现有的国内外报道, 本文总结缺血后处理方式的异同, 重新评价不同缺血后处理方式对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的影响.

应用要点

本研究表明了缺血后处理在大鼠肝移植缺血再灌注损伤中的作用, 可以应用于肝移植临床, 有利于肝移植术后患者的恢复.

同行评价

本文创新性较好, 为进一步的临床应用提供了理论基础.

备注

编辑:李薇 电编:何基才

参考文献

1.	Starzl TE, Demetris AJ. Liver transplantation: a 31-year perspective. Part III. Curr Probl Surg. 1990;27:181-240.  [PubMed]  [DOI]

2.	Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, Kerendi F, Wang NP, Guyton RA, Vinten-Johansen J. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285:H579-H588.  [PubMed]  [DOI]

3.	Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 1986;74:1124-1136.  [PubMed]  [DOI]

4.	Yin DP, Sankary HN, Chong AS, Ma LL, Shen J, Foster P, Williams JW. Protective effect of ischemic preconditioning on liver preservation-reperfusion injury in rats. Transplantation. 1998;66:152-157.  [PubMed]  [DOI]

5.	Chen H, Xing B, Liu X, Zhan B, Zhou J, Zhu H, Chen Z. Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after renal ischemia/reperfusion injury in rat. Transpl Int. 2008;21:364-371.  [PubMed]  [DOI]

6.

Sínay L, Kürthy M, Horváth S, Arató E, Shafiei M, Lantos J, Ferencz S, Bátor A, Balatonyi B, Verzár Z. Ischaemic postconditioning reduces peroxide formation, cytokine expression and leukocyte activation in reperfusion injury after abdominal aortic surgery in rat model. Clin Hemorheol Microcirc. 2008;40:133-142.  [PubMed]  [DOI]

7.	Xing B, Chen H, Zhang M, Zhao D, Jiang R, Liu X, Zhang S. Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat. Stroke. 2008;39:2362-2369.  [PubMed]  [DOI]

8.	Wang JY, Shen J, Gao Q, Ye ZG, Yang SY, Liang HW, Bruce IC, Luo BY, Xia Q. Ischemic postconditioning protects against global cerebral ischemia/reperfusion-induced injury in rats. Stroke. 2008;39:983-990.  [PubMed]  [DOI]

9.	Vinten-Johansen J. Postconditioning: a mechanical maneuver that triggers biological and molecular cardioprotective responses to reperfusion. Heart Fail Rev. 2007;12:235-244.  [PubMed]  [DOI]

10.	Cohen MV, Yang XM, Downey JM. The pH hypothesis of postconditioning: staccato reperfusion reintroduces oxygen and perpetuates myocardial acidosis. Circulation. 2007;115:1895-1903.  [PubMed]  [DOI]

11.	Lauzier B, Delemasure S, Debin R, Collin B, Sicard P, Acar N, Bretillon L, Joffre C, Bron A, Creuzot-Garcher C. Beneficial effects of myocardial postconditioning are associated with reduced oxidative stress in a senescent mouse model. Transplantation. 2008;85:1802-1808.  [PubMed]  [DOI]

12.	Kin H, Zhao ZQ, Sun HY, Wang NP, Corvera JS, Halkos ME, Kerendi F, Guyton RA, Vinten-Johansen J. Postconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion. Cardiovasc Res. 2004;62:74-85.  [PubMed]  [DOI]

13.	Yağmurdur MC, Ozdemir A, Topaloğlu S, Kilinç K, Ozenç A. Effects of alpha tocopherol and verapamil on liver and small bowel following mesenteric ischemia-reperfusion. Turk J Gastroenterol. 2002;13:40-46.  [PubMed]  [DOI]

14.	Jaeschke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003;284:G15-G26.  [PubMed]  [DOI]

15.	Teoh NC, Farrell GC. Hepatic ischemia reperfusion injury: pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection. J Gastroenterol Hepatol. 2003;18:891-902.  [PubMed]  [DOI]

16.

Kin H, Wang NP, Mykytenko J, Reeves J, Deneve J, Jiang R, Zatta AJ, Guyton RA, Vinten-Johansen J, Zhao ZQ. Inhibition of myocardial apoptosis by postconditioning is associated with attenuation of oxidative stress-mediated nuclear factor-kappa B translocation and TNF alpha release. Shock. 2008;29:761-768.  [PubMed]  [DOI]