三氧化二砷在低氧下对人肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响

摘要

目的: 探讨低氧条件下三氧化二砷(As₂O₃)对人肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响.

方法: 用氯化钴(CoCl₂)创造低氧条件, 取1.0、2.0、4.0、8.0 µmol/L的As₂O₃分别在常氧和低氧条件下作用于HepG2细胞12、24和48 h后, MTT法检测细胞活力, Hoechst染色法检测细胞凋亡. 设常氧对照组、低氧对照组、低氧下不同浓度As₂O₃(4.0、8.0 µmol/L)组, 用免疫细胞化学法观察不同浓度As₂O₃作用于HepG2细胞48 h后HIF-1α蛋白表达的变化.

结果: MTT法和Hoechst染色法分别显示, 在常氧和低氧两种条件下, As₂O₃均呈时间剂量依赖性地抑制和诱导HepG2细胞增殖和凋亡(均P<0.01), 8.0 µmol/L As₂O₃作用HepG2细胞48 h后其抑制率和凋亡率分别为38.40%, 37.83%和45.25%, 49.28%. 在常氧和低氧两种条件下, HepG2细胞生长抑制率及凋亡率的差异均无统计学意义. 免疫细胞化学法显示, 常氧条件下HIF-1α蛋白呈弱阳性表达, 低氧诱导48 h后HIF-1α蛋白表达显著升高(t = 114.37, P<0.05), 低氧条件下HIF-1α蛋白表达随As₂O₃浓度的增加而逐渐降低(F = 347.042, P<0.01).

结论: 低氧条件下, As₂O₃能抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡, 其机制可能与As₂O₃下调HIF-1α的表达有关.

关键词: 三氧化二砷; 低氧; 肝癌细胞; 低氧诱导因子-1α

Effects of arsenic trioxide on cell proliferation, apoptosis and HIF-1α expression in human liver cancer HepG2 cells cultured under hypoxic conditions

De-Tao Xia, Dong Zhang, Wei-Ling Xiao

De-Tao Xia, Wei-Ling Xiao, Department of Clinical Medicine, Weifang Medical College, Weifang 261053, Shandong Province, China

Dong Zhang, Wulian People's Hospital Affiliated to Weifang Medical College, Rizhao 262300, Shandong Province, China

Supported by: the Scientific Research Foundation for Young Teachers in Weifang Medical College, No. KQ07007.

Correspondence to: De-Tao Xia, Department of Clinical Medicine, Weifang Medical College, Weifang 261053, Shandong Province, China. xiadt23@163.com

Received: May 1, 2010
Revised: July 7, 2010
Accepted: July 12, 2010
Published online: August 28, 2010

Abstract

AIM: To investigate the effects of arsenic trioxide (As₂O₃) on cell proliferation, apoptosis and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) expression in human liver cancer HepG2 cells cultured under hypoxic conditions.

METHODS: Hypoxia was induced with cobalt chloride (CoCl₂). After HepG2 cells were incubated with different concentrations of As₂O₃ (1.0, 2.0, 4.0 and 8.0 µmol/L) for 12, 24 and 48 h under hypoxic conditions, cell proliferation was determined by MTT assay, and cell apoptosis was evaluated by Hoechst staining. HepG2 cells were then divided into three groups: normal control group, hypoxia group, and As₂O₃ treatment group. After HepG2 cells were incubated with As₂O₃ at concentrations of 4.0 and 8.0 µmol/L for 48 h under hypoxia, the expression of HIF-1α protein was detected by immunocytochemistry.

RESULTS: As₂O₃ inhibited proliferation but induced apoptosis of HepG2 cells in a dose- and time-dependent manner under both normoxic and hypoxic conditions (both P < 0.01). No significant differences were noted in the reduced proliferation rates of cell proliferation (38.40% vs 37.83%, P > 0.05) and apoptosis rates (45.25% vs 49.28%, P > 0.05) between HepG2 cells treated with 8.0 µmol/L As₂O₃ for 48 h under normoxic and hypoxic conditions. Immunocytochemistry analysis revealed that HIF-1α was weakly expressed in HepG2 cells under normoxia. After hypoxic induction for 48 h, HIF-1α expression was significantly up-regulated (t = 114.37, P < 0.05). The expression of HIF-1α protein gradually decreased with the increase in the concentration of As₂O₃ under hypoxia (F = 347.042, P < 0.01).

CONCLUSION: As₂O₃ can inhibit proliferation but induce apoptosis of HepG2 cells under hypoxia possibly by down-regulating HIF-1α protein expression.

Key Words: Arsenic trioxide; Hypoxia; Liver cancer cell; Hypoxia-inducible factor-1α

0 引言

研究已经证实, 肿瘤内存在低氧微环境[1,2]. 低氧微环境导致多种实质性肿瘤包括肝癌发生一系列生物学效应, 使肿瘤细胞发生一系列适应性变化, 如促进肿瘤血管生成、增强无氧糖酵解、凋亡耐受等[3], 而低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha, HIF-1α)是肿瘤低氧应答的关键因子, HIF-1α与肿瘤血管生成、化疗抵抗、无氧糖酵解及恶性演进、浸润转移等密切相关[4-7]. 大量研究表明, 低氧微环境是导致肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗的重要原因[4-7]. 因此, 寻找低氧条件下仍然有效的抗肿瘤药物成为目前研究的热点[8]. 三氧化二砷(arsenic trioxide, As₂O₃)是砒霜的主要成分之一, 最初被用于急性早幼粒细胞白血病的治疗, 随后发现其对胃癌、肺癌、肝癌等多种实体瘤具有明显的杀伤作用[9-11]. 近年来研究表明, As₂O₃在低氧条件下能诱导肺癌细胞、急性早幼粒白血病等一些肿瘤细胞发生凋亡[12,13], 但其对低氧条件下肝癌细胞的作用及相关机制有待进一步探讨. 为此, 我们以经典的化学缺氧剂CoCl₂模拟低氧微环境, 分别在常氧和低氧条件下观察了不同浓度As₂O₃对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡的影响, 探讨其与HIF-1α蛋白表达的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2购自山东省医学科学院. As₂O₃注射液购自黑龙江哈尔滨医大药业有限公司. Hoechst32258荧光染色试剂盒及CoCl₂购于美国Sigma公司. DMEM培养基及甲基噻唑基四唑(MTT)购自美国Gibco公司. 胎牛血清(杭州四季青)、PV-9000免疫组织化学试剂盒及鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 取指数生长期的人肝癌细胞株HepG2接种于含100 mL/L胎牛血清、青霉素、链霉素各1×10⁵ U/L的DMEM培养液中, 置于37 ℃, 50 mL/L CO₂培养箱内常规传代培养.

1.2.2 低氧培养条件: 预先在常氧条件下培养, 待细胞贴壁进入对数生长期后加入化学缺氧剂CoCl₂, 其终浓度为150 μmol/L, 置于37 ℃, 50 mL/L CO₂培养箱内常规传代培养.

1.2.3 MTT法检测HepG2细胞增殖抑制率: 分别观察常氧和低氧条件下不同浓度As₂O₃对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制的影响. 取对数生长期的人肝癌HepG2细胞, 按照3×10⁷/L的密度接种于96孔培养板, 每孔体积为200 μL. 待细胞贴壁后分别加入As₂O₃(终浓度1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L), 并设阴性对照组(细胞正常生长组), 每个浓度组设5个复孔, 四周加入不含药物的细胞培养液为空白对照. 分别在常氧和低氧条件下培养至12、24和48 h后, 每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL, 继续培养4 h, 吸出培养液, 每孔加入DMSO 150 μL, 振荡10 min, 在酶标仪上以490 nm波长测每孔的吸光度A值, 并取5孔的平均值. 实验重复3次, 计算细胞生长抑制率. 细胞生长抑制率 = (对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%.

1.2.4 Hoechst染色法检测HepG2细胞凋亡率: 分别观察常氧和低氧条件下不同浓度As₂O₃对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响. 取对数生长期的HepG2细胞制成2×10⁸/L的细胞悬液, 每孔0.5 mL, 加入放有盖玻片的24孔板内. 待细胞贴壁后分别加入As₂O₃(终浓度1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L), 并设阴性对照组(细胞正常生长组), 每个浓度组设5个复孔, 分别在常氧及低氧条件下培养12、24、48 h后, 取出细胞爬片, 甲醇/冰醋酸固定液固定5 min后, 加入荧光染液Hoechst33258重悬细胞, 室温避光l h, PBS冲洗, 用抗荧光液封片. 然后置于BH-2型荧光显微镜下, 采用激发波长350 nm, 发射波长460 nm镜检. 判定标准: 正常细胞核为蓝色, 凋亡的细胞核为白色. 每片连续观察10个细胞分布均匀的200倍镜视野, 每视野计数50个细胞, 共500个细胞, 计算其阳性率百分数, 并取其均值. 凋亡率 = 凋亡细胞数/(正常细胞数+凋亡细胞数).

1.2.3 免疫细胞化学两步法观察低氧条件下HepG2细胞HIF-1α的表达: 取对数生长期的HepG2细胞制成2×10⁸/L的细胞悬液, 每孔0.5 mL, 加入放有盖玻片的24孔板内, 设常氧对照组、低氧对照组和低氧下不同浓度As₂O₃组, 待细胞贴壁后分别加入CoCl₂和As₂O₃(终浓度4.0、8.0 μmol/L), 48 h后取出细胞爬片, 冷丙酮固定5 min, PBS冲洗, 按PV-9000试剂盒步骤检测HIF-1α, DAB显色, 脱水, 透明, 中性树胶封片. 用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照, 以PBS代替一抗作为阴性对照. 结果判定: 细胞核内出现棕黄色颗粒判定HIF-1α为阳性. 采用HPAIS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统, 检测HIF-1α蛋白阳性细胞的平均A值, 以间接反映HIF-1α阳性蛋白的表达量, 并取其均值.

统计学处理 实验数据用mean±SD表示, 数据均用统计软件SPSS16.0分析, 组间比较用t检验和单因素方差分析, 两变量间用Pearson直线相关分析, P<0.05为有统计学意义.

2 结果

2.1 常氧和低氧条件下不同浓度As₂O₃对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制的影响

不同浓度As₂O₃在常氧和低氧条件下作用于HepG2细胞12、24和48 h后, 均呈时间剂量依赖性地抑制HepG2细胞增殖(常氧下F = 119.527, 218.732, 364.612, 低氧下F = 283.116, 341.629, 514.721, 均P<0.01), 在常氧和低氧条件下8.0 μmol/L As₂O₃作用HepG2细胞48 h后其增殖抑制率分别为38.40%和37.83%. 对照组内各时间点HepG2细胞增殖抑制率均无显著差异. HepG2细胞增值抑制率在相同作用时间、相同处理浓度, 但在常氧和低氧两种条件下的差异无统计学意义(表1).

表1 常氧和低氧条件下不同时间、As₂O₃浓度对HepG2细胞的增殖抑制率 (mean±SD, %).

As2O3(μmol/L)	12 h			24 h			48 h
	常氧条件	低氧条件		常氧条件	低氧条件		常氧条件	低氧条件
对照组	2.85±1.13		2.92±1.08	2.83±1.02		2.94±1.17	2.92±1.14		2.89±1.03
1.0	5.75±4.23b	5.82±2.11b		9.23±2.46bd	9.46±1.52bd		16.73±1.26bd	17.03±1.04bd
2.0	9.57±3.16b	9.71±3.21b		18.33±1.37bd	17.96±2.11bd		26.35±3.14bd	27.13±2.46bd
4.0	16.19±4.02b		16.32±5.13b	24.14±2.18bd		24.36±3.02bd	31.63±2.77bd		32.04±1.76bd
8.0	22.01±1.82b		21.89±1.79b	28.26±2.71bd		28.69±2.43bd	38.40±3.25bd		37.83±3.46bd

^bP<0.01 vs 同样条件下的细胞对照组;

^dP<0.01 vs 同样12 h浓度组.

2.2 Hoechst染色法检测As₂O₃对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

不同浓度As₂O₃在常氧和低氧条件下作用于HepG2细胞12、24和48 h后, 均呈时间剂量依赖性地促进HepG2细胞凋亡(常氧下F = 382.429, 469.517, 719.262, 低氧下F = 457.323, 639.216, 882.541, 均P<0.01), 8.0 µmol/L As₂O₃作用HepG2细胞48 h后其凋亡率分别为45.25%和49.28%. 对照组内各时间点HepG2细胞凋亡率均无显著差异. HepG2细胞凋亡率在相同作用时间、相同处理浓度, 但在常氧和低氧两种条件下的差异无统计学意义(表2, 图1).

图1 Hoechst染色法检测As₂O₃作用48 h后HepG2细胞的凋亡(×200). A: 常氧对照组; B: 常氧下8.0 µmol/L As₂O₃组; C: 低氧对照组; D: 低氧下8.0 µmol/L As₂O₃组.

表2 常氧和低氧条件下不同时间、As₂O₃浓度对HepG2细胞凋亡的影响 (mean±SD, %).

As2O3(μmol/L)	12 h			24 h			48 h
	常氧条件	低氧条件		常氧条件	低氧条件		常氧条件	低氧条件
对照组	1.04±0.11		2.08±0.47	1.32±0.21		2.11±0.17	1.24±0.14		2.32±0.12
1.0	4.85±0.53b	6.51±0.36b		8.93±1.31bd	12.37±0.87bd		12.41±1.16bd	17.58±1.21bd
2.0	6.73±0.75b	10.69±0.93b		15.12±1.48bd	18.75±0.94bd		20.50±2.31bd	24.86±1.73bd
4.0	12.79±1.23b		15.13±1.21b	20.36±2.41bd		24.13±1.64bd	29.22±2.42bd		32.31±2.05bd
8.0	23.26±1.62b		25.45±1.23b	27.39±2.56bd		31.18±2.21bd	45.25±1.18bd		49.28±1.46bd

^bP<0.01 vs 同样条件下的细胞对照组;

^dP<0.01 vs 同样12 h浓度组.

2.3 低氧条件下不同浓度As₂O₃对HepG2细胞HIF-1α表达的影响

常氧条件下HIF-1α蛋白呈弱阳性表达, 加入CoCl₂创造低氧条件诱导48 h后HIF-1α蛋白表达显著升高(t = 114.37, P<0.05), 低氧条件下4.0、8.0 µmol/L As₂O₃作用细胞48 h后, HIF-1α蛋白表达随As₂O₃浓度的增加而逐渐降低, 与低氧对照组比较有统计学意义(0.546±0.028, 0.395±0.017 vs 0.773±0.047, F = 347.042, 均P<0.01, 图2).

图2 免疫细胞化学检测HepG2细胞HIF-1α蛋白的表达(SP×400). A: 阴性对照组; B: 常氧对照组; C: 低氧对照组; D: 低氧下8.0 µmol/L As₂O₃组.

3 讨论

低氧微环境是多种实质性肿瘤包括肝癌在内的共同特征, 其缺氧主要是由于肿瘤细胞生长失控, 而血管生长却相对滞后, 致使耗氧量超过了微血管所能提供的氧量, 从而导致肿瘤内低氧微环境的形成[14]. 低氧微环境可使肿瘤基因组和蛋白质组不稳定, 导致介导肿瘤细胞的恶性筛选出现化疗耐受, 进而浸润转移[3]. 而低氧诱导HIF-1α表达与肿瘤的血管生成、凋亡耐受、化疗抵抗及侵袭转移等方面密切相关[4-7]. 低氧微环境是肿瘤细胞对多种化疗药物如氟尿嘧啶、阿霉素等产生抵抗性的重要原因[15,16], Tan等[17]体外实验发现, 低氧可降低SW480细胞对氟尿嘧啶的敏感性, 其机制可能与上调HIF-1α、血红素氧合酶-1表达有关. 因此, 寻找以HIF-1α为靶点的、低氧下仍然有效的抗肿瘤药物成为国内外研究的热点[8,18]. 研究发现, As₂O₃对胃癌、肺癌、肝癌等多种实体瘤具有明显的杀伤作用[9-11], 近年来研究表明, As₂O₃在低氧条件下能诱导肺癌细胞、急性早幼粒白血病等一些肿瘤细胞发生凋亡[12,13], 但其对低氧条件下肝癌细胞的作用及相关机制报道不多.

我们在常氧和低氧两种条件下系统地观察了不同浓度As₂O₃对HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其与HIF-1α表达的关系. MTT实验发现: 在常氧和低氧两种条件下, As₂O₃均可呈剂量和时间依赖性地显著抑制HepG2细胞的增殖, 8.0 µmol/L As₂O₃作用HepG2细胞48 h后, 其抑制率分别为38.40%和37.83%, 常氧和低氧两种条件下细胞增殖抑制率的差异无统计学意义. 最近, Qu等[13]研究发现, As₂O₃可以在低氧环境下抑制人肺癌细胞生长并诱导其凋亡, 可能与阻滞细胞周期进程有关. 我们应用Hoechst染色法进一步观察, 结果显示在常氧和低氧两种条件下, 不同浓度As₂O₃均呈时间剂量依赖性促进HepG2细胞凋亡, 8.0 µmol/L As₂O₃作用HepG2细胞48 h后其凋亡率分别为45.25%和49.28%, 常氧和低氧条件下细胞凋亡率的差异无统计学意义. 上述结果表明, As₂O₃可以通过诱导细胞凋亡来发挥对HepG2细胞的杀伤作用, 这种作用不受低氧条件的影响. Pettersson等[11]发现, As₂O₃对小细胞肺癌有高度细胞毒性, 能诱导肺癌细胞发生凋亡, 但其具体机制有待深入研究. 刘晓川等[19]研究亦发现, 缺氧条件下As₂O₃能诱导人肝癌BEL-7402细胞发生凋亡, 其机制可能与As₂O₃下调HIF-1α、多药耐药基因的表达有关. HIF-1是低氧条件下产生的一种异源二聚体转录因子, 主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成, 其中HIF-1α是主要的氧调节亚单位, 对HIF-1的活性起着关键作用. 许多研究表明, 低氧诱导HIF-1α表达使肿瘤细胞耐受凋亡[12,13]. 为此, 我们进一步应用免疫细胞化学法观察发现, 低氧下HIF-1α表达较常氧下明显升高(均P<0.05), 而As₂O₃呈剂量依赖性地抑制HIF-1α表达, 与低氧对照组比较有统计学意义(均P<0.01). 近年来, 许多研究亦发现, HIF-1α表达下调可增强抗肿瘤药物的杀伤作用[6,20]. Kung等[21]实验发现, 应用一种多肽阻断HIF-1α与p300/CREB的结合以阻遏HIF-1α的转录活性, 该多肽可以抑制结肠癌和乳腺癌移植瘤的生长. 研究发现, 低氧下As₂O₃能对急性早幼粒细胞白血病细胞产生生长抑制作用, 其中HIF-1α和维甲酸受体α发挥了重要作用[12]. 最近, 邢国辉等[22]研究发现, 在低氧环境下, 丹参酮ⅡA可增强5-氟尿嘧啶抑制SGC-7901细胞增殖及诱导凋亡作用, 可能与其抑制HIF-1α及突变型P53蛋白表达有关. 因此, 我们推测, 低氧条件下As₂O₃可能通过下调HIF-1α的表达诱导HepG2细胞的凋亡, 从而发挥对HepG2细胞的杀伤作用.

我们的研究结果提示, As₂O₃可能通过下调HIF-1α的表达诱导细胞凋亡来发挥对HepG2细胞的杀伤作用, 这种作用不受低氧条件的影响, 为其合理的运用于临床提供理论思路. 预示着As₂O₃在肝癌的治疗上有着广泛的前景, 其具体的作用机制有待进一步研究.

评论

背景资料

肿瘤低氧微环境是肿瘤化疗抵抗的重要原因, HIF-1α是重要的氧调节转录因子, 寻找以HIF-1α为靶点的、低氧下仍然有效的抗肿瘤药物成为国内外研究的热点. 三氧化二砷对多种实体瘤具有杀伤作用, 近年来研究发现, 三氧化二砷在低氧条件下能诱导肺癌细胞、急性早幼粒白血病等一些肿瘤细胞发生凋亡, 但其对低氧条件下肝癌细胞的作用及相关机制报道不多.

同行评议者

吴君, 主任医师, 贵阳医学院附属医院感染科

研发前沿

大量研究表明, 低氧微环境是导致肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗的重要原因. 因此, 寻找低氧条件下仍然有效的抗肿瘤药物成为目前研究的热点.

创新盘点

本研究以经典的化学缺氧剂CoCl2模拟低氧微环境, 分别在常氧和低氧两种条件下观察不同浓度三氧化二砷对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响, 并研究其与低氧下重要的分子标志物HIF-1α蛋白表达的关系, 这有望为肝癌的治疗提供合理的用药及科学的理论基础.

应用要点

本研究发现, 在低氧条件下, 三氧化二砷仍具有抗肿瘤活性, 且与常氧条件下相比, 其抗肿瘤能力没有减弱, 这种作用可能与其抑制HIF-1α蛋白表达有关. 研究结果表明, 三氧化二砷作为一种对HIF-1α具有抑制作用的抑制剂, 在临床治疗中可作为一种重要的辅助化疗药物与化疗药物联用, 增强化疗药物的抗肿瘤能力.

同行评价

本文设计合理, 为三氧化二砷将来应用于临床提供了一些数据, 有一定的实际应用价值.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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