修回日期: 2010-04-27
接受日期: 2010-04-27
在线出版日期: 2010-06-08
目的: 探讨低相对分子质量蛋白酶体(LMP)基因单核苷酸多态性(SNP)与HBV感染结局之间的关联.
方法: 提取287例HBV持续感染者(包括无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化患者)及278例健康对照外周血基因组DNA, 用PCR-RFLP方法分析LMP2/LMP7基因Codon60/Codon145两个多态性位点的基因型.
结果: LMP7基因多态性位点在健康对照与无症状HBV携带者之间的差异有统计学意义(P<0.05), 与携带Gln/Gln基因型者比较, 携带Gln/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加3.35倍(95%CI: 2.02-5.58), 携带Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加3.46倍(95%CI: 1.41-8.48), 携带至少1个Lys等位基因者(即Gln/Lys和Lys/Lys基因型) 乙型肝炎患病风险增加3.37倍(95%CI: 2.06-5.52); LMP7基因多态性位点在健康对照与进展性肝炎(包括慢性乙型肝炎和肝硬化)患者之间的差异有统计学意义(P<0.05), 与携带Gln/Gln基因型者比较, 携带Gln/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加2.22倍(95%CI: 1.48-3.32), 携带Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加4.33倍(95%CI: 2.15-8.73), 携带至少1个Lys等位基因者(即Gln/Lys和Lys/Lys基因型)乙型肝炎患病风险增加2.49倍(95%CI: 1.69-3.65); LMP2/LMP7基因多态性位点在无症状HBV携带者与进展性肝炎患者间的差异无统计学意义(P>0.05).
结论: LMP7基因可能是无症状HBV携带和进展性肝炎的易感基因; LMP基因多态性与HBV感染的结局可能无明显相关性.
引文著录: 施超, 刘黎, 钱燕华, 崔倩, 顾静, 董美华, 林玉娣, 喻荣彬. LMP2/LMP7基因多态性与乙型肝炎病毒感染结局的关系. 世界华人消化杂志 2010; 18(16): 1664-1668
Revised: April 27, 2010
Accepted: April 27, 2010
Published online: June 8, 2010
AIM: To investigate the possible association between LMP2/LMP7 gene polymorphisms and outcome of hepatitis B virus (HBV) infection.
METHODS: Peripheral blood leukocytes were isolated from 287 patients with persistent HBV infection, including 100 asymptomatic HBV carriers (AsC group) and 187 patients with active liver diseases such as chronic hepatitis B and liver cirrhosis (ALD group), and 278 healthy volunteers for extraction of genomic DNA. LMP gene polymorphisms were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).
RESULTS: The prevalence of LMP7 codon 145 Gln/Lys heterozygote, Lys/Lys homozygote, and Gln/Lys plus Lys/Lys genotypes was significantly higher in the AsC group than in healthy controls (OR = 3.35, 3.46 and 3.37; 95%CI: 2.02-5.58, 1.41-8.48 and 2.06-5.52; all P < 0.001). Similarly, the prevalence of LMP7 codon 145 Gln/Lys heterozygote, Lys/Lys homozygote, and Gln/Lys plus Lys/Lys genotypes was significantly higher in the ALD group than in healthy controls (OR = 2.22, 4.33 and 2.49; 95%CI: 1.48-3.32, 2.15-8.73 and 1.69-3.65; all P < 0.001). However, there was no significant difference in LMP2/LMP7 polymorphisms between the AsC and ALD groups.
CONCLUSION: The LMP7 gene polymorphisms may be associated with susceptibility to asymptomatic HBV infection and active liver diseases, but not with the clinical outcome of persistent HBV infection.
- Citation: Shi C, Liu L, Qian YH, Cui Q, Gu J, Dong MH, Lin YD, Yu RB. Association between LMP2/LMP7 gene polymorphisms and outcome of hepatitis B virus infection. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(16): 1664-1668
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i16/1664.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i16.1664
人类对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)普遍易感, 成人感染HBV后绝大多数可以清除病毒, 只有5%-10%的人会持续感染并发展成不同程度的慢性肝病. 感染HBV后临床表现多样性的原因, 除病毒本身和环境因素外, 宿主的遗传因素可能是影响乙型肝炎发生、发展和预后的重要因素之一[1,2]. 低相对分子质量蛋白酶体(low molecular-weight protein, LMP)是1982年Monaco[3]在分析鼠MHC-Ⅱ类分子的免疫沉淀复合物时得到的产物, 能够水解抗原成为适合的肽段, 经转运后与MHC-Ⅰ类分子连接, 并表达于细胞表面, 被CD8+ T淋巴细胞所识别, 因此LMP对于机体内源性和外源性抗原的免疫应答有着极其重要的作用. 目前已有研究表明, LMP基因的多态性与一系列免疫相关性疾病的发生有着密切关联[4,5], 有报道称LMP基因多态性与HBV感染有关联[6,7]. 但尚无开展LMP基因多态性与HBV感染不同结局的关联性研究, 为此本研究选取LMP2、LMP7基因中具有氨基酸改变的两个多态性位点, 探讨LMP基因多态性与HBV感染不同结局的关联性.
HBV持续感染组均为2006-12/2009-09于无锡市传染病医院和无锡市101医院住院或门诊就诊的患者. 诊断依据中华医学会肝病学分会和感染病学分会2005年制定的《慢性乙型肝炎防治指南》, 将HBV持续感染组分为两组: (1)无症状HBV携带(asymptomatic carriers, AsC): HBsAg阳性持续1年以上、HbsAb阴性、ALT水平正常(≤40 U/L), 共100例; (2)慢性进展性肝病(active liver disease, ALD): 包括慢性乙型肝炎和肝硬化患者, HBsAg阳性、HbsAb阴性、ALT水平异常升高(>40 U/L)、慢性肝炎病程1年以上, 共187例. 所有研究对象均为无亲缘关系的汉族人, 均无原发性心、肺、肾及高血压等病史, 排除其他慢性肝病的致病因素存在, 如非HBV感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝等. 按照和HBV持续感染组性别、年龄成组匹配原则, 对照组选自本地健康体检人员, 共278例. 所有研究对象在填写知情同意书后, 采用专门设计的问卷进行流行病学调查, 并采集静脉血5 mL置-20 ℃保藏备检.
1.2.1 基因组DNA抽提: 采用酚/氯仿抽提法提取HBV持续感染者、健康正常人外周血DNA共565例, 标准方案参照文献[8]制定.
1.2.2 多态性位点的选择及引物设计:LMP2/LMP7基因位于染色体6p21.3区, 根据文献选择分别位于第四和第一外显子的两个SNP位点[6,9], 每个多态碱基的改变均引起所编码氨基酸的改变. 所选SNP最小等位基因频率大于10%. 从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)数据库中检索到LMP2/LMP7基因Codon60/Codon145两个多态性位点的基因序列, 利用PIRA-PCR (http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer2.html)网站, 分别设计每个位点的PCR扩增引物(表1). 引物由上海英骏生物技术有限公司合成.
| 基因 | 碱基和氨基酸替换 | PCR引物 | 退火温度(℃) | 内切酶和片段长度(bp) | SNP位点rs号 |
| LMP2 | 60(GCA→ACA) | 5-GTGAACCGAGTGTTTGACAAGC-3 | 56 | Hin6Ⅰ(39+213) | rs17587 |
| Arg→His | 5-GCCAGCAAGAGCCGAAACAAG-3 | ||||
| LMP7 | 145(CAG→AAG) | 5-TCATGGCGCTACTAGATGTATG-3 | 54 | BsmⅠ(146+205) | rs2071543 |
| Gln→Lys | 5-AACTCTTTGTCCTAACTTGCAC-3 |
1.2.3 PCR反应体系及反应条件: 首先使用MJ PTC-200型PCR扩增仪进行梯度PCR, 确定退火温度(表1)后进行多态性位点PCR扩增, PCR扩增体系及程序如下: ddH2O 14.2 μL, 10×PCR缓冲液(含1.5 mmol/L Mg2+)1.2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.2 μL, Taq酶0.2 μL(10 U/μL), 上、下游引物各0.2 μL(20 μmol/L), DNA模板1 μL(50 ng). PCR扩增程序: 94 ℃预变性2 min, 94 ℃变性40 s→退火40 s, 退火温度分别为56 ℃(LMP2-Codon60)、54 ℃(LMP7-Codon145)→72 ℃延伸40 s, 共30个循环, 最后在72 ℃条件下延伸10 min.
1.2.4 RFLP法判断LMP2/LMP7基因型: 两种PCR产物分别采用限制性内切酶Hin6Ⅰ和BsmⅠ(NEB公司), 对LMP2-Codon 60与LMP7-Codon 145两个位点进行酶切基因分型. 反应体系均为8 μL, 其中ddH2O 4 μL、PCR产物约3 μL、内切酶0.3 μL(10 U/μL)、加内切酶相应的10×Buffer 0.7 μL, 分别在37 ℃和65 ℃下水浴8 h. 最后进行琼脂糖凝胶电泳, 根据电泳条带判断每一个体LMP2/LMP7的基因型.
统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学分析. 以方差分析(One-Way ANOVA)比较对照组、无症状HBV携带组和慢性进展性肝病三组之间年龄、ALT和AST的差异, 以χ2检验比较三组之间性别分布以及Hardy-Weinberg平衡检验. 多态性与HBV不同临床结局之间的关联以比值比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(confidence interval, CI)表示, 采用非条件Logistic回归模型分析, 调整年龄、性别等因素. 均为双侧概率检验, P<0.05表示具有统计学意义.
对照组、无症状HBV携带组和进展性肝炎组之间的年龄、性别构成差异无统计学意义, 三组之间ALT、AST差异有统计学意义(P<0.05, 表2).
对照组LMP2和LMP7基因型的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P = 0.284, P = 0.947), 说明具有人群代表性. LMP2-Codon 60位点和LMP7-Codon145位点的基因型分布及其与HBV感染不同临床结局的关系见表3.
| Entype | 对照组n = 278(%) | AsC组n = 100(%) | ALD组n = 187(%) | AsC组 vs 对照组a | ALD组 vs 对照组a | AsC组 vs ALD组a | |||
| P值 | n(95%CI) | P值 | n(95%CI) | P值 | n(95%CI) | ||||
| LMP2 | |||||||||
| Arg/Arg | 192(69.1) | 70(70.0) | 133(71.1) | - | 1.00(reference) | - | 1.00(reference) | - | 1.00(reference) |
| Arg/His | 81(29.1) | 26(26.0) | 45(24.1) | 0.533 | 0.85(0.51-1.44) | 0.296 | 0.80(0.52-1.22) | 0.828 | 0.94(0.53-1.66) |
| His/His | 5(1.8) | 4(4.0) | 9(4.8) | 0.207 | 2.41(0.62-9.40) | 0.089 | 2.65(0.86-8.12) | 0.806 | 1.16(0.35-3.92) |
| Arg/His+His/His | 86(30.9) | 30(30.0) | 54(28.9) | 0.798 | 0.94(0.57-1.55) | 0.622 | 0.90(0.60-1.36) | 0.911 | 0.97(0.57-1.66) |
| LMP7 | |||||||||
| Gln/Gln | 163(58.6) | 30(30.0) | 68(36.4) | - | 1.00(reference) | - | 1.00(reference) | - | 1.00(reference) |
| Gln/Lys | 100(36.0) | 60(60.0) | 93(49.7) | 0.000 | 3.35(2.02-5.58) | 0.000 | 2.22(1.48-3.32) | 0.135 | 0.66(0.38-1.14) |
| Lys/Lys | 15(5.4) | 10(10.0) | 26(13.9) | 0.007 | 3.46(1.41-8.48) | 0.000 | 4.33(2.15-8.73) | 0.797 | 1.12(0.48-2.62) |
| Gln/Lys+Lys/Lys | 115(41.4) | 70(70.0) | 119(63.6) | 0.000 | 3.37(2.06-5.52) | 0.000 | 2.49(1.69-3.65) | 0.233 | 0.73(0.43-1.23) |
在调整年龄和性别后, LMP2-Codon60位点多态性在对照组与无症状HBV携带组之间: Arg/Arg→Arg/His、Arg/Arg→His/His、Arg/Arg→Arg/His+His/His基因型频率的比较, 差异均无统计学意义(P>0.05). LMP7-Codon145位点多态性在对照组与无症状HBV携带组之间: Gln/Gln→Gln/Lys基因型频率比较, 差异有统计学意义(OR = 3.35, 95%CI: 2.02-5.58, P<0.001); Gln/Gln→Lys/Lys基因型频率的比较, 差异有统计学意义(OR = 3.46, 95%CI: 1.41-8.48, P = 0.007); Arg/Arg→Gln/Lys+Lys/Lys基因型频率的比较, 差异有统计学意义(OR = 3.37, 95%CI: 2.06-5.52, P<0.001).
在调整年龄和性别后, LMP2-Codon60位点多态性在对照组与进展性肝炎组之间: Arg/Arg→Arg/His、Arg/Arg→His/His、Arg/Arg→Arg/His+His/His基因型频率的比较, 差异均无统计学意义(P>0.05). LMP7-Codon145位点多态性在对照组与进展性肝炎组之间: Gln/Gln→Gln/Lys基因型频率比较, 差异有统计学意义(OR = 2.22, 95%CI: 1.48-3.32, P<0.001); Gln/Gln→Lys/Lys基因型频率的比较, 差异有统计学意义(OR = 4.33, 95%CI: 2.15-8.73, P<0.001); Arg/Arg→Gln/Lys+Lys/Lys基因型频率的比较, 差异有统计学意义(OR = 2.49, 95%CI: 1.69-3.65, P<0.001).
近年来有关LMP基因多态性与HBV感染的关系受到人们关注, 已有病例对照研究分析了LMP2/LMP7基因多态性与HBV感染的关系[6,7]. 其中, 一个基于北京地区人群的研究显示, LMP7基因的多态性与HBV感染有着显著的关联[7], 与携带Gln/Gln基因型者比较, 携带Gln/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加2.11倍(95%CI: 1.36-3.26)、携带Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加2.66倍(95%CI: 1.17-6.02). 另外一个基于北京和山东人群的研究, 同样也发现LMP7基因的多态性与HBV感染有着显著的易感关联[6], 与携带Gln/Gln基因型者比较, 携带Gln/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加1.58倍(95%CI = 1.15-2.17)、携带Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加2.33倍(95%CI: 1.11-4.85).
本研究首次对LMP2/LMP7基因多态性与HBV感染不同结局之间的关系进行研究, 结果显示LMP7基因Codon145位点多态性在无症状HBV携带者和正常人群之间、进展性肝炎患者和正常人群之间的频率分布差异均有统计学意义(P<0.05); LMP2基因Codon60位点多态性在无症状HBV携带者和正常人群之间、进展性肝炎患者和正常人群之间的频率分布差异均无统计学意义(P>0.05). 结果提示LMP7可能是无症状HBV携带和进展性肝炎的易感基因, 与之前研究结果基本一致, 究其原因, 可能是由于LMP7基因多态性能够改变其水解后肽段的长度或裂解片段的模式, 进而影响与MHC-Ⅰ类分子连接. 例如LMP7能增强酶体对碱性、中性氨基酸残基后切割, 但不影响酸性残基后切割, 而在基因位点改变后所编码的LMP蛋白酶体水解抗原所得到的肽段羧基末端多为酸性氨基酸残基[10]. 研究发现, 碱基及疏水性氨基酸残基与MHC-Ⅰ类分子结合力强, 而酸性氨基酸残基与MHC-Ⅰ类分子结合力弱[11,12], 故LMP7基因多态性可决定肽段羧基端氨基酸的性质, 进而对抗原处理和递呈过程起到限制性作用, 使得在后一步TAP1/TAP2介导的抗原肽至内质网呈递过程中成为重要的限速步骤, 因而是HBV感染的易感因素之一.
然而, 研究结果也显示LMP2/LMP7基因多态性位点在无症状HBV携带与进展性肝炎两组人群中的差异均无统计学意义(P>0.05), 提示LMP基因与HBV感染不同临床结局之间可能不存在关联性. 乙型肝炎的发病是一个多种环境因素、多个病理进程、多种遗传因素相互作用的结果, 相对于遗传易感因素来说, 存在诸多因素影响其对疾病的作用, 如实验表明, LMP2和LMP7受IFN-γ诱导而合成增加, 作为功能单位进入蛋白酶体, 从而改变了蛋白酶体的糜蛋白酶样水解活性[13,14], 可能影响蛋白酶体在细胞内加工抗原的效率和肽谱, 诱发不同的病理过程, 因此LMP基因与HBV感染不同结局之间的关系, 可能受到IFN-γ基因多态性的影响. 本实验初步发现LMP7基因多态性与HBV感染预后之间可能不存在明显的相关性, 但由于本实验还有一些不足, 因此还需要进一步考虑其他因素的影响, 采用更大样本量进行全面、深入研究, 以便更准确地了解HBV感染转归的影响因素.
人群感染HBV后临床表现多样性的原因, 除病毒本身和环境因素外, 宿主的遗传因素可能是影响乙型肝炎发生、发展和预后的重要因素之一. 近年来有关LMP基因多态性与HBV感染的关系受到人们关注.
李定国, 教授, 上海交通大学医学院附属新华医院消化内科
已有研究表明, LMP基因多态性与一系列免疫相关性疾病的发生有着密切关联, 有报道称LMP基因多态性与HBV感染有关联, 但尚无LMP基因多态性与HBV感染不同结局的关联性研究报道.
戴悦等研究显示, LMP7基因的多态性与HBV感染有着显著关联, 携带Gln/Lys和Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险分别增加2.11和2.66倍. Xu等研究也得出类似的结论. 本文则对LMP2/LMP7基因多态性与HBV感染不同结局的关系进行了探讨.
本次研究得出LMP7基因Codon145位点多态性在无症状HBV携带者和正常人群之间、进展性肝炎患者和正常人群之间的频率分布差异均有统计学意义, 提示LMP7可能是无症状HBV携带和进展性肝炎的易感基因.
低相对分子质量蛋白酶体(LMP): 能够水解抗原成为适合的肽段, 经转运后与MHC-Ⅰ类分子连接, 表达于细胞表面, 被CD8+ T细胞识别, 对于机体免疫应答有着极其重要的作用. LMP基因多态性与一些免疫相关性疾病的发生有着密切关联.
本文在阐明LMP2/LMP7基因多态性与HBV感染的相关性方面具有一定价值, 对慢性乙型肝炎的预防、诊断和治疗也有潜在的指导意义, 能够较好地反映我国胃肠病学临床和基础研究的先进水平.
编辑: 曹丽鸥 电编: 吴鹏朕
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