乙型肝炎病毒促进CTGF和TGF-β1在肝星状细胞中的表达

摘要

目的: 研究转染乙型肝炎病毒(HBV)的HepG2.2.15细胞株在体外促进肝星状细胞中CTGF和TGF-β1的表达, 进而探讨HBV促肝细胞纤维化的机制.

方法: 将HepG2和HepG2.2.15细胞株分别在体外与肝星状细胞(LX-2)共培养, 以单独培养的肝星状细胞为对照组. 培养24, 48, 72 h后, 以Real-time PCR定量检测肝星状细胞中CTGF和TGF-β1 mRNA的表达, 以Western blot定量检测其蛋白表达.

结果: 与对照组比较, 在24、48、72 h时点, CTGF和TGF-β1 mRNA分别增高约1.7、4.2、9.6倍(P<0.05)和2.2、6.1、8.1倍(P<0.01), 以72 h差异最为显著; 而与HepG2细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1 mRNA在三个时间点分别增高约1.7、1.2、1.3倍(P<0.05)和2.7、1.9、2.1倍(P<0.05). CTGF和TGF-β1蛋白表达量分别增高约2.1、2.6、2.5倍(P<0.05)和1.7、3.3、3.1倍(P<0.01), 以48 h差异最为显著; 而与HepG2细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1蛋白表达量在三个时间点分别增高约1.6、1.1、0.9倍(P<0.05)和1.1、1.4、2.5倍(P<0.05).

结论: 与HepG2.2.15细胞株共培养后, 肝星状细胞中肝纤维化相关因子的表达明显增强. 体外实验证明HBV具有诱导肝细胞纤维化的重要作用.

关键词: 乙型肝炎病毒; 肝纤维化; 细胞共培养; 结蒂组织生长因子; 转化生长因子β1

Hepatitis B virus induces expression of connective tissue growth factor and transforming growth factor-β1 in hepatic stellate cells

Ming-Hao Ha, Hui-Ying Rao, Feng Liu, Xiao-Ben Pan, Bo Feng, Hong-Song Chen, Lai Wei

Ming-Hao Ha, Hui-Ying Rao, Feng Liu, Xiao-Ben Pan, Bo Feng, Hong-Song Chen, Lai Wei, Hepatology Institute, Peking University, Beijing 100044, China

Ming-Hao Ha, People's Hospital of Dongguan City, Dongguan 523000, Guangdong Province, China

Supported by: the National Science and Technology Key Program of China during the 10th Five-Year Plan Period, No. 2004BA718B10.

Correspondence to: Dr. Lai Wei, Hepatology Institute, People's Hospital, Peking University, 11 Xizhimen South Avenue, Beijing 100044, China. weelai@163.com

Received: December 24, 2007
Revised: February 26, 2008
Accepted: March 8, 2008
Published online: March 28, 2008

Abstract

AIM: To investigate whether HepG2.2.15 cell line induces the expression of connective tissue growth factor (CTGF) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in hepatic stellate cells and the mechanism of hepatitis B virus (HBV) in inducing fibrogenesis.

METHODS: The hepatic stellate cells (LX-2) were co-cultured with HepG2 or HepG2.2.15 in vitro and the LX-2 cells cultured alone were used as controls. After culturing for 24, 48 and 72 h, real-time polymerase chain reaction (PCR) was performed to detect the expression of CTGF and TGF-β1 mRNA in LX-2 cells. Western-blot analysis was used to measure the expression of CTGF and TGF-β1 proteins in LX-2 cells.

RESULTS: After 24, 48, and 72 h, the expression of CTGF and TGF-β1 mRNA in LX-2 cells co-cultured with HepG2.2.15 were higher than those in the controls (CTGF: 1.7, 4.2, 9.6 times higher, P < 0.05; TGF-β1: 2.2, 6.1, 8.1 times higher, P < 0.01), and the most eminent effect was found at 72 h; however, CTGF and TGF-β1 mRNA expression in LX-2 cells co-cultured with HepG2 were 1.7, 1.2, 1.3 and 2.7, 1.9, 2.1 times higher than those in the controls (all P < 0.05). At the same time point, the protein expression of CTGF and TGF-β1 in LX-2 cells co-cultured with HepG2.2.15 (CTGF: 2.1, 2.6, 2.5 times higher, P < 0.05; TGF-β1: 1.7, 3.3, 3.1 times higher, P < 0.01) or HepG2 (CTGF: 1.6, 1.1, 0.9 times higher, P < 0.05; TGF-β1: 1.1, 1.4, 2.5 times higher, P < 0.05) were also higher than those in the control cells.

CONCLUSION: The expression of fibrosis-related factors in hepatic stellate cells are increased significantly after co-culturing with HepG2.2.15, which proves that HBV can induce fibrogenesis in vitro.

Key Words: Hepatitis B virus; Hepatic fibrosis; Cell co-culture; Connective tissue growth factor; Transforming growth factor-β1

0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染呈世界性流行, 但不同地区HBV感染的流行强度差异很大. 全世界有3.5亿慢性HBV感染者, 每年约有50-120万人死于HBV感染相关的并发症[1-4]. HBV的感染导致肝细胞的损伤和炎症, 与肝纤维化和肝细胞癌的发生呈强相关性[5-8].

肝纤维化的发生是由于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过多积聚, 构成ECM的主要成分是胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ[9-13]. 激活的肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是合成ECM的主要效应细胞[16-18]; 转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1是促纤维化合成最重要的细胞因子, 能强有力的促进ECM的合成和积聚[19-21]; 结蒂组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是在TGF-β1诱导作用下, 由人上皮细胞合成分泌, 作为TGF-β1下游调控因子调控纤维化反应[22-25].

虽然研究表明HBV与肝细胞纤维化、肝硬化呈强相关性; 但是HBV致肝细胞纤维化的机制仍未阐明. 特别是感染HBV的肝细胞是否促进了肝细胞纤维化的发生, 如果感染了HBV的肝细胞促进了肝细胞纤维化的发生, 其机制及调控通路是什么. 本研究利用体外细胞共培养技术对这一课题进行研究.

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)高糖培养基以及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Hyclone公司; RNA反转录试剂, 荧光定量PCR反应扩增仪TaKaRa Ex Taq R-PCR Version.2.1均购自TaKaRa公司; 人肝星状细胞系LX-2, 由Friedman教授和徐列明教授(上海中医药大学肝病研究所)惠赠, HepG2和HepG2.2.15细胞系为本所保存细胞系, Transwell细胞共培养系统购自Corning公司, 小鼠抗人CTGF和TGF-β1一抗购自R&D公司, PBS由北京大学人民医院生产. BCATM蛋白定量试剂盒和ECL Western印染发光试剂购自Pierce公司, 硝酸纤维素膜购自Gelman公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞共培养: 以含100 mL/L FBS DMEM培养基分别培养LX-2、HepG2和HepG2.2.15细胞, 选取生长状态良好的细胞, 按照HepG2和HepG2.2.15细胞与LX-2细胞比例分别为4∶1接种于Transwell细胞共培养系统中. HepG2和HepG2.2.15细胞接种于可渗透性滤膜上层; LX-2细胞接种于可渗透性滤膜下层. LX-2细胞接种密度为5×10⁷个/L, HepG2和HepG2.2.15细胞接种密度为2×10⁸个/L. 对照组LX-2细胞按照5×10⁷个/L密度接种于普通6孔板, 无其他细胞与其共培养. 等待细胞生长至50%融合度时以PBS漂洗三遍, 加入含2 mL/L FBS DMEM培养基培养至72 h.

1.2.2 引物设计: 利用Bioedit软件设计引物. CTGF上游引物序列: TGCGACTCCAC CCTCCAGC,下游引物序列: GGCGGTC ATGGTTGGCACTG; TGF-β1上游引物序列: TTGCTCCCTCCCTGCCCC, 下游引物序列: CAGGAGACAGGCCGGGGATG.

1.2.3 RNA逆转录: 逆转录体系为: Total RNA 1.5 μg, MgCl₂ 2 μL, 10×RT Buffer 1 μL, dNTP 1 μL, RNase Inhibitor 0.25 μL, AMV Rverse Transcriptase 0.5 μL, Oligo dT primer 0.5 μL, RNase free ddH2O 3.75 μL. 反应按照以下过程进行: 30℃ 10 min, 42℃ 50 min, 95℃ 5 min, 4℃ 5 min.

1.2.4 Real-time PCR(Sybr Green法): 反应体系为: TaKaRa Ex Taq 0.25 μL, PCR Forward Primer 0.5 μL, PCR Reverse Primer 0.5 μL, dNTP Mixture 0.75 μL, 模板1 μL, Mg2+ Solution 0.5 μL, 5×Real time PCR Buffer(Mg²⁺ Free)5 μL, Even green 2.5 μL, 加ddH2O至总体系25 μL. PCR反应条件: 95℃ 120 s, 95℃ 15 s, 60℃ 20 s, 72℃ 20 s. 将预实验的PCR产物按照测A值后以10倍浓度梯度进行稀释, 选择1/1000, 1/10 000, 1/100 000, 1/1 000 000浓度的稀释产物作为标准品模版, 进行荧光定量PCR反应并同时在荧光定量PCR仪中输入以上4个浓度梯度的浓度数值. 通过这4个标准品生成的反应数据, 软件Rotor-Gene 6.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系, 生成标准曲线. 通过此标准曲线来计算在标准曲线所划定的CT值时的样品浓度. 通过所得到的浓度可计算出样品在此刻的拷贝数.

1.2.5 Western blot: 参照Bio-Rad公司提供的配胶方案配制12%分离胶和5%积层胶. 积层胶聚合时, 蛋白样品与2×上样缓冲液等体积混合, 100℃煮沸5 min使蛋白变性. 用微量移液器按预定顺序加样, 每孔上样50 μg总蛋白. 上样后, 200 V稳压条件下进行电泳, 直至溴酚兰到达分离胶底部(约45 min), 关闭电源结束电泳. 转膜后, 把硝酸纤维素膜转移到杂交袋中室温下摇床预杂交3 h按0.1 mL/cm²膜面积加入5% Blotto预杂交液及分别加入1∶200至1∶1000稀释度的小鼠抗CTGF和TGF-β1抗体, 4℃摇床过夜. 5% Blotto预杂交液漂洗3次, 每次15 min. 按0.1 mL/cm²膜面积加入5% Blotto预杂交液及分别加入1∶1000稀释度的辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体, 室温下摇床杂交45 min. 5% Blotto预杂交液漂洗1次, 15 min, 0.05% TBS-T漂洗2次, 每次10 min, 1×TBS漂洗1次, 10 min. ECL显影, 用Umax2100XL扫描仪以及Quantity One图像分析软件测定条带的吸光度值(A), 以CTGF和TGF-β1的光密度值/β-actin的光密度值代表CTGF和TGF-β1蛋白的相对表达量.

统计学处理 数据均以mean±SD表示, 用SPSS11.0统计软件, 组间差异采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 Real-time PCR法检测与HepG2、HepG2.2.15细胞共培养后LX-2细胞中CTGF和TGF-β1 mRNA的差异表达

各实验组均取同样条件下培养的3份标本进行检测, 取其平均值. 将单独培养组LX-2细胞中CTGF和TGF-β1 mRNA的表达量设定为1倍, 将共培养实验组LX-2细胞中CTGF和TGF-β1 mRNA表达量与其比较. 发现, 与HepG2细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1 mRNA在24、48、72 h时间点分别增高约1.7、1.2、1.3倍(P<0.05)和2.7、1.9、2.1倍(P<0.05); 与HepG2.2.15细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1 mRNA在24、48、72 h时间点分别增高约1.7、4.2、9.6倍(P<0.05)和2.2、6.1、8.1倍(P<0.01). 其中以72 h与HepG2.2.15共培养组LX-2细胞中CTGF和TGF-β1 mRNA表达差异最为显著(图1).

图1 Real-time PCR法检测与HepG2、HepG2. 2.15细胞共培养后LX-2细胞中mRNA的差异表达. A: CTGF; B: TGF-β1.

2.2 Western blot检测与HepG2、HepG2.2.15细胞共培养后LX-2细胞中CTGF和TGF-β1蛋白的差异表达

各实验组均取同样条件下培养的3份标本进行检测, 取其平均值. 发现与正常对照组相比, 与HepG2细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1蛋白表达量在24、48、72 h时间点分别增高约1.6、1.1、0.9倍(P<0.05)和1.1、1.4、2.5倍(P<0.05); 与HepG2.2.15细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1蛋白表达量在24、48、72 h时间点分别增高约2.1、2.6、2.5倍(P<0.05)和1.7、3.3、3.1倍(P<0.01). 其中以48 h与HepG2.2.15共培养组LX-2细胞中CTGF和TGF-β1蛋白表达量增高最为显著(图2).

图2 Western blot检测与HepG2、HepG2. 2.15细胞共培养后LX-2细胞中蛋白的差异表达. A: CTGF; B: TGF-β1. 1: 对照组; 2: 与HepG2细胞共培养; 3: 与HepG2.2.15细胞共培养; ^bP<0.01 vs 对照组.

3 讨论

多种研究表明, 抑制HSC的表达明显减少肝纤维化基质的沉积[26-27]. 至目前为止, 尚未有研究表明HBV能够感染HSC, 也未有感染了HBV的HSC细胞建系成功. 缺乏HBV直接感染HSC的证据, 对于研究HBV致肝细胞纤维化的机制提出新的难题. 转染了HBV的HepG2.2.15细胞上清中含有HBV的各种蛋白及HBV的复制中间体[28], 是目前研究HBV的有效模型. 我们对HepG2.2.15细胞与HSC共培养后能否促进HSC纤维化表达增强进行了研究.

在实验中我们利用了细胞共培养技术. Transwell细胞共培养系统的优点是: 利用聚碳酸酯膜将两种细胞分隔开, 避免了两种细胞的直接作用, 而直径小的多的细胞因子可以自由通过膜, 在细胞间发挥调控作用.

TGF-β1在肝纤维化发生过程中具有重要作用. TGF-β1诱导ECM的合成和积聚, 是肝纤维化反应的中心调控因子. TGF-β1还能促进胶原纤维的合成并下调金属基质蛋白的表达[29-31].

本文对与HepG2和HepG2.2.15细胞共培养后的LX-2细胞中CTGF和TGF-β1的表达, 从基因水平和蛋白水平进行了检测. 本研究发现, 同对照组相比, 与HepG2和HepG2.2.15细胞共培养后的LX-2细胞中CTGF和TGF-β1的表达水平均有明显升高, 与HepG2.2.15细胞共培养后效应更为显著. 其中与HepG2.2.15细胞共培养后CTGF和TGF-β1 mRNA的表达在72 h升高最为明显; CTGF和TGF-β1蛋白的表达量在48 h亦有明显升高.

本研究利用体外细胞共培养技术, 证明了与HepG2细胞相比, HepG2.2.15细胞能明显促进HSC中CTGF和TGF-β1的表达. 而CTGF和TGF-β1在肝纤维化的过程中具有重要促进作用, 我们的实验证明HBV可能通过促进HSC中肝纤维化相关调控蛋白的表达, 发挥重要的致肝细胞纤维化的作用.

评论

背景资料

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行, HBV的感染导致肝细胞的损伤和炎症, 与肝纤维化和肝细胞癌的发生呈强相关性.

同行评价者

党双锁, 副教授, 西安交通大学第二医院感染科.

创新盘点

本研究以体外共培养实验证明HBV通过感染肝细胞释放促肝纤维化因子诱导肝纤维化的形成.

应用要点

本文证明HBV感染后致肝纤维化的调控途径, 明确了HBV促进释放的重要促纤维化因子, 为临床治疗HBV感染后肝纤维化指明靶点.

名词解释

细胞共培养技术: 是指以Transwell细胞共培养系统, 利用聚碳酸酯膜将两种细胞分隔开, 避免了两种细胞的直接作用, 而直径小的多的细胞因子可以自由通过膜,在细胞间发挥调控作用.

同行评价

本研究实用性强, 方法先进, 结果可靠, 是一篇好的论文.

备注

编辑:程剑侠 电编:何基才

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