抗胃癌单链抗体可变区序列分析及空间结构模拟

摘要

目的: 考察抗人胃癌抗体可变区轻、重链序列, 选择合适的连接肽构建单链抗体, 并模拟其三级结构, 预测单链抗体结构与功能关系.

方法: 利用获得的源自抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出的抗体可变区轻、重链序列, 通过分析抗体轻重链可变区C-端、N-端结构特征, 选择合适的连接肽, 进而利用分子模拟原理构建单链抗体可变区的空间构象; 经过力学优化、动力学模拟确定其稳定的三维结构; 借助距离几何学、表观静电分布、溶液可及性表面积分析, 对单链抗体的结构特征及理化性质进行理论分析.

结果: 成功获得的单链抗体稳定构象, 除连接肽位置的1个氨基酸构象不合理之外, 其他位置构象合适. 轻链CDR1、CDR2以及重链CDR3溶液可及性表面积分布较强, 而轻链CDR3、重链CDR1、CDR2分布较弱. 重链CDR3区带有较强的负电性.

结论: 所构建的单链抗体三维空间结构具有较高的合理性和可靠性.

关键词: 胃癌; 单链抗体; 力学优化; 动力学模拟; 溶液可及性表面积; 表观静电分布

Analysis of primary structure and modeling of spatial structure of single-chain variable region of antibody against human gastric cancer

Li-Juan Yang, Ying-Chun Hou, Yu-Jie Bai, Li-Bo Yao, Cheng-Zhi Su

Li-Juan Yang, Department of Endocrinology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Ying-Chun Hou, School of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, Shaanxi Province, China

Yu-Jie Bai, Adinovo Center for Genetic and Genomic Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang Province, China

Li-Bo Yao, Cheng-Zhi Su, Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University of Chinese PLA, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

Correspondence to: Li-Juan Yang, Department of End-ocrinology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China. ljyang2828@163.com

Received: April 28, 2008
Revised: May 21, 2008
Accepted: June 2, 2008
Published online: July 28, 2008

Abstract

AIM: To analyze the sequence of heavy and light chain of the variable region (V_H and V_L) in the anti-human gastric cancer antibody, select a suitable linker peptide to construct single chain antibody, model the 3-D structure and predict the relationship between its structure and function.

METHODS: Using the sequences of V_H and V_L, which derived from the phage display library of antibodies against human gastric cancer, a suitable linker peptide was chosen to obtain the primary structure of the single-chain antibody with considering the C-terminal and N-terminal structural character. Furthermore, the 3-D theoretical structure was modeled with computer-guided homology modeling method. The stable spatial conformation of the single-chain variable region was determined with mechanism optimization and molecular dynamic simulation. The structural property and physical-chemical characters were analyzed using the distance geometry, surface electrostatic distribution and solvent accessible surface calculation.

RESULTS: The conformation of the successfully constructed single-chain antibody was stable. Except one amino acid conformation of connecting peptide, others' were reasonable. V_L CDR1, CDR2 and V_H CDR3 solution accessibility surface area distributed strongly, but V_L CDR3, V_H CDR1, and CDR2 were comparatively weak. V_H CDR3 region had strong electronegativity.

CONCLUSION: The 3-D structure of the created single chain antibody is proved reasonable and reliable.

Key Words: Gastric cancer; Single-chain antibody; Mechanism optimization; Molecular dynamic simulation; Solvent accessible surface; Surface electrostatic distribution

0 引言

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率及病死率均为恶性肿瘤的第1位[1], 因此, 胃癌的早期诊断和有效治疗就显得极为重要. 单链抗体作为抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段, 在肿瘤的早期诊断和治疗中越来越受到人们的广泛关注. 本研究利用源自噬菌体抗体库技术获得的鼠抗人胃癌轻、重链可变区片段, 通过分析其N-端、C-端序列及结构特征, 选择合适的连接肽构建单链抗体, 经计算机辅助分子模拟方法构建其空间构象. 利用相关理论方法对其结构进行分析, 预测了结构功能关系, 为进一步抗体的合理改造奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

细菌菌株E.coli TG1, 克隆及表达载体pCANTAB5E, 分别扩增轻链可变区片段(VL)和重链可变区片段(VH), 引物及RS Primer Mix均为Pharmacia公司产品. 其他有关分子生物学试剂系华美公司和Promega公司产品. InsightⅡ(2005)软件包为MSI公司产品.

1.2 方法

抗人胃癌抗体轻、重链序列参见文献[2]. 分析人胃癌抗体轻、重链可变区序列, 借助其空间构象分析其N-、C-端结构特征, 选择合适的连接肽(GGGGS)3, 利用分子模拟方法搭建单链抗体空间构象. 依次选择CVFF力场、Gromos96力场, 利用Discover、Discover_3程序包, 经最陡下降、共轭梯度算法进行分子力学优化; 通过常温动力学模拟, 收集100个稳定构象进行分析, 最终确定单链抗体的稳定构象. 利用Profile_3D对单链抗体的结构进行可信性分析; 进而通过Access_Surf模块对单链抗体的表面溶液可及程度进行分析; 利用Delphi程序, 考虑溶剂效应进行表观静电分布分析.

2 结果

2.1 抗人胃癌单链抗体结构模拟

考察抗体重链、轻链可变区N、C端氨基酸理化特征, 选择合适的连接肽(GGGGS)3, 构建单链抗体可变区序列. 通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlastP, 检索PDB数据库, 得到模板蛋白, 其PDB注册号为1h8s. 利用同源模建方法搭建其三维结构, 通过分子力学、动力学模拟获得其稳定构象(图1A-B).

图1 单链抗体及其CDR区空间构象. A: 单链抗体空间构象; B: 单链抗体CDR区构象分布. 绿色部分代表FR及Linker构象, 粉色代表轻链CDR区构象, 红色代表重链CDR构象.

2.2 抗人胃癌单链抗体结构评估

为评判模拟构象结构的可靠性, 我们对优化获得的单链抗体空间结构进行了理论评估, 结果模拟的构象除连接肽位置的1个氨基酸构象不合理之外, 其他位置构象合适(图2).

图2 Profile_3D对于模拟的单链抗体构象结构评估.

2.3 抗人胃癌单链抗体性质

轻链CDR1、CDR2以及重链CDR3溶液可及性表面积分布较强, 而轻链CDR3、重链CDR1、CDR2分布较弱, 提示在发挥作用的过程中, 重链CDR3区参与跟抗原的结合(图3-4). 重链CDR3区带有较强的负电性, 提示在与相应抗原作用过程中, 通过与正电的抗原表位发生静电作用(图5).

图3 单链抗体可及性表面积分布情况.

图4 单链抗体质量、轻链CDR可及性表面积分布情况. A: 轻链; B: 重链.

图5 单链抗体表观静电分布. 利用Delphi程序对于单链抗体表观静电分布的理论分析, 其中红色部分代表负电区, 蓝色部分代表正电区, 白色部分代表中性区.

3 讨论

人们通过对类似蛋白质空间结构的对比发现, 蛋白质的三维结构较其一级序列更为保守. 因此, 用类似蛋白来预测目标蛋白的空间构象是比较可靠的[6]. 据此原理, 人们已成功预测了许多目标蛋白, 在抗体的结构预测中尤为突出[4-10], 这对抗体工程的发展具有十分重要的意义, 能够使人们在了解抗体空间结构及其与生物学功能关系之基础上, 对已有的抗体分子加以改造, 使其更符合临床诊断和治疗的需要.

小分子抗体具有分子小, 免疫原性弱, 穿透力强易于进入实体瘤周围的微循环, 血清和全身廓清快, 无肾脏蓄积作用, 肿瘤显像时清晰度高, 可作载体与药物、同位素、毒素等结合之优点[11], 在肿瘤的诊断和治疗方面有极高的理论和应用价值. 单链抗体是小分子抗体的一种, 其由VH和VL和连接肽构成, 是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段. 本研究利用计算机辅助分子设计与蛋白空间结构模拟技术, 利用获得的源自抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出的VH、VL序列, 通过分析抗体轻重链可变区C-端、N-端结构特征, 选择合适的连接肽, 进而利用分子模拟原理构建单链抗体可变区的空间构象; 经过力学优化、动力学模拟确定其稳定的三维结构; 借助距离几何学、表观静电分布、溶液可及性表面积分析, 对单链抗体的结构特征及理化性质进行了理论分析. 获得的单链抗体构象表明, 其CDR区形成合理的口袋结构, 易于结合抗原表位而发挥功能. 这为该抗体的进一步合理化改造提供了理论依据.

评论

背景资料

在肿瘤的诊断治疗中, 抗体占有很重要的作用. 本研究利用噬菌体抗体库技术, 绕过杂交瘤技术, 获得了鼠抗人胃癌重链及轻链可变区片段, 并通过分析其N-端、C-端序列及结构特征, 选择合适的连接肽构建单链抗体, 经计算机辅助分子模拟方法构建其空间构象. 为今后胃癌的显像和导向治疗奠定了一定的基础.

同行评议者

李奇林, 教授, 南方医科大学附属珠江医院急诊部.

研发前沿

目前所获得的抗体大部分为鼠源性, 在应用过程中会引发HAMA反应而限制了其应用. 必须先进行人源化改造, 才能更好地应用于临床. 如何进行人源化改造是亟待研究的问题.

相关报道

人们通过对类似蛋白质空间结构的对比发现, 蛋白质的三维结构较其一级序列更为保守. 氨基酸残基序列有50%相同的蛋白质, 约有90%的Ca原子偏差不超过0.3 nm, 均方根偏差约0.1 nm, 氨基酸的残基替换通常发生在蛋白质表面回折区域. 蛋白质主链结构, 特别是疏水中心的结构受序列变异的影响很小. 因此, 用类似蛋白来预测目标蛋白的空间构象是比较可靠的.

创新盘点

C本文先从噬菌体抗体库着手, 得到抗体重链及轻链可变区片段后, 选择合适的连接肽, 利用三维重建得到空间结构, 为人源化改造奠定基础.

同行评价

本文在查阅了大量文献资料的基础上进行设计, 对胃癌的研究有较大的指导性, 为防治消化系肿瘤提供了较好的基础研究理论.

备注

编辑:李军亮 电编:郭海丽

参考文献

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