COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选

摘要

目的: 构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA (shRNA)的表达质粒.

方法: 从NCBI网站获得大鼠的COL1A1 cDNA序列, 根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列, 相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中, 即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C. 为得到高效沉默COL1A1-siRNA, 以脂质体LipofectAMINE2000, 将1、2、3、4 μg DNA质粒转染至HSC-T6细胞中, 并观察转染效果. 将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞, RT-PCR分析各组的COL1A1 mRNA表达水平.

结果: 靶向COL1A1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析, shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 经酶切凝胶电泳证实载体构建成功. 1、2、3、4 μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%, 以2 μg siRNA为最佳剂量, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%, 63.3%和80.3%.

结论: 筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1 mRNA的表达, 从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.

关键词: 前Ⅰ型胶原α1链; 肝星状细胞; RNA干扰; 质粒; 逆转录-聚合酶链反应

Construction of COL1A1-shRNA expression plasmid and screening of effective sequences to inhibit COL1A1 expression

Jun Lu, Jin-Man Zhao, Yan Meng, Yong-Hong Yu

Jun Lu, Jin-Man Zhao, Yan Meng, Yong-Hong Yu, Department of Gastroenterology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Supported by: the Science and Technology Foundation of the Colleges and Universities of Liaoning Education Office, No. 05L452.

Correspondence to: Dr. Jin-Man Zhao, Department of Gastroenterology, the First Hospital of China Medical University, 155 Nanjing Northern Street, Heping District, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. jinmanzhao@163.com

Received: January 8, 2008
Revised: March 19, 2008
Accepted: May 20, 2008
Published online: May 28, 2008

Abstract

AIM: To construct and select procollagen type 1 alpha 1 (COL1A1) short hairpin RNA (shRNA) expression plasmid that can inhibit COL1A1 mRNA expression in rat hepatic stellate cell (HSC).

METHODS: Rat COL1A1 cDNA sequence was obtained from NCBI website. Three small interfering RNA sequences were selected through online design of the Whitehead Institute. The corresponding double-stranded DNA was used to construct pGPU6/GFP/Neo plasmids, namely pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B and pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C. HSC-T6 cells were transfected with a green fluorescent protein (GFP)-labeled siRNA to assess the transfection efficiency. To get most effective and optimal dosage siRNA, the three plasmids (1, 2, 3, 4 μg) were transfected into HSC-T6 cells with Lipofectamine 2000 respectively, and the untreated HSC-T6 cells were used as controls. The expression of COL1A1 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) after the most effective and optimal dosage was used.

RESULTS: The expression plasmids targeting on COL1A1 mRNA were successfully constructed, and confirmed by agarose electrophoresis and sequence analysis. The transfection efficiencies at a dose of 1, 2, 3, and 4 μg were approximately 16.7%, 20.3%, 23.5%, and 22.3%, and 2 μg was considered as the most optimal dosage in each group. The inhibitory rates of COL1A1 mRNA levels in the HSC-T6 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B, and pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C were 16.6%, 63.3%, and 80.3%, respectively, when 2 μg siRNA plasmid was used.

CONCLUSION: The constructed expression plasmid pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C can effectively inhibit the expression of COL1A1 mRNA, providing a new method and material for the treatment of liver fibrosis.

Key Words: Procollagen type 1 alpha 1; Hepatic stellate cell; RNA interference; Plasmid; Reverse transcription-polymerase chain reaction

0 引言

肝纤维化是各种病因引起的慢性肝病, 使肝脏中胶原蛋白的增生和降解失衡, 进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程, 最终可导致肝硬化. 在肝纤维化中细胞外基质(extracellular matrix, ECM)主要成分是胶原, 其中Ⅰ型胶原为主要成分, 现已证明肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)激活是产生Ⅰ型胶原导致纤维化发生发展的中心环节, 通过减少HSC中前Ⅰ型胶原的产生, 逆转或减慢肝纤维化的发展[1-2]. RNAi技术是一种新型发展起来的技术手段, 现今被广泛应用到疾病治疗研究中. RNAi是一种进化上保守的基因组水平的免疫监控机制, 通过RNaseⅢ内切核酸酶Dicer的作用产生小的(21-23 nt)短小扰性RNA(short interfering RNA, siRNA), 介导其互补同源mRNA序列的特异性降解, 能高效、特异地阻抑细胞内源或外源性靶基因的表达[3-5]. 本研究构建以U6启动子控制下的能产生针对COL1A1的短发夹环状小干扰RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达质粒, shRNA能在RNA多聚酶Ⅲ(Pol H1)启动子的控制下从DNA模板合成, RNA Pol HI能介导3端以4-5个T结尾的小的、非编码的转录的合成. 拟用构建质粒转染大鼠肝星转细胞, 筛选出能高效沉默Ⅰ型胶原序列.

1 材料和方法

1.1 材料

主要试剂真核表达载体pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛公司; E.coli DH5α购自Invitrogen公司; 质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司; 逆转录试剂盒购自Promega公司; TRIzol(r)试剂购自Invitrogen公司; 限制性内切酶BamHⅠ、BbsⅠ、T4连接酶、Taq酶, 脂质体转染试剂盒LipofectAMINE2000和DMEM购自宝生生物工程有限公司; DNA2000Marker, G418(Gibco公司); 小牛血清购自杭州四季青生物公司; 大鼠肝星状T6细胞由中国肿瘤医院生物检测中心惠赠.

1.2 方法

1.2.1 目的基因RNAi靶点设计和合成shRNA: 在GenBank中找到大鼠HSC的α1(Ⅰ)mRNA基因序列, 序列号为NM_053304(GeneID: 29393), 应用Whitehead研究所的siRNA设计软件, 通过计算机网络(网站为http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA)辅助设计siRNA, 结合RNAi效率预测公式进行评估, 包括分析自由能特性, 与mRNA的空间可接触性, 排除偏靶(off-target)效应等, 最终筛选出3条理论上最佳的siRNA序列Col1a1-A: 5'-GAGTATGGAAGCGAAGGTTCC-3', 3'-CTCATACCTTCGCTTCCAAGG-5'. Col1a1-B: 5'-ACAAGGTGACAGAGGCATAAA-3', 3'-TGTTCCACTGTCTCCGTATTT-5'; Col1a1-C:5'-TGATGGTTCTCCTGGCAAAGA-3', 3'-ACTACCAAGAGGACCGTTTCT-5'; 同时设阴性对照. 作为阴性对照的siRNA应和选中的siRNA序列有相同的组成, 但和mRNA没有明显的同源性. 将选中的siRNA序列打乱设计阴性对照序列5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3', 5'-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3', 同样检查结果以保证和靶细胞中其他基因没有同源性. shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号, shRNA的转录终止序列采用T6结构. 正义链模板的5'端添加了CACC, 与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补; 反义链模板的5'端添加了GATC, 与BamHⅠ酶切后形成的黏端互补; 如果siRNA的第一个碱基不是G, 则在CACC后补加一个G(以上正义链和反义链由上海吉玛生物公司合成). 将DNA oligo分别用TE(pH8.0)溶解, 浓度为100 μmol/L. 取相应的正义链和反义链oligo溶液, 按照如下配比配置退火反应体系, 在PCR仪上按照如下程序进行退火处理: 95℃ 5 min; 85℃ 5 min; 75℃ 5 min; 70℃ 5 min; 4℃保存. 退火处理后得到的shRNA模板, 用于连接反应.

1.2.2 酶切和连接反应: 载体pGPU6/GFP/Neo经BamHⅠ, BbsⅠ双酶切, 37℃酶切1 h, 琼脂糖电泳, 使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0 回收, 电泳检测估算浓度, 稀释浓度至50 mg/L. 将退火片段与经酶切后的载体混和进行连接反应, 置22℃水浴反应过夜过夜.

1.2.3 重组质粒的转化、筛选和鉴定: 各取连接产物5 μL接种到大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行转化, 分别接种于卡那霉素抗性的LB平板上, 37℃恒温箱培养过夜. 分别挑取单克隆菌落接种于LB培养液中(含卡那霉素终浓度为30 mg/L), 37℃恒温摇床培养过夜, 用小提试剂盒小量提取质粒, 并分别用BamHⅠ, PstⅠ分别酶切鉴定. 阳性重组载体应该可以被BamHⅠ切开, 而不能被PstⅠ切开. 收集酶切鉴定正确的重组质粒, 送上海英骏生物技术有限公司进行测序鉴定. 将构建成功的载体分别命名为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C、阴性对照载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N. 将鉴定证实的细菌扩增培养, 摇至对数生长期, 每0.8 mL过夜培养细菌加0.2 mL无菌甘油, 混匀后-70℃冰箱保存.

1.2.4 HSC-T6细胞培养及转染: 将大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)细胞接种至225 cm²培养瓶中, 每瓶加入15 mL DMEM混合培养液(含100 mL/L FBS及100 kU/L青霉素、100 g/L链霉素、4 mmol/L谷氨酰胺及l mol/L HEPES), 置37℃, 50 mL/L恒温CO₂培养箱中, 细胞为贴壁生长, 每3天以2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 转染前一天24孔板培养细胞, 设定1、2、3、4 μg, 不同量的DNA质粒, 每个四个复孔, 按照脂质体转染试剂盒LipofectAMINE2000操作说明转染细胞, 质粒和脂质体以1:4配比, 转染后48 h, 消化细胞, 流式细胞仪测定转染效率. 选取最佳剂量进行转染, 转染后24 h传代, 加入G418进行筛选, G418浓度为600 mg/L, 2 wk后挑取单克隆株扩大培养. 获得稳定表达细胞系, 分别建立表达pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C和阴性对照的单克隆大鼠肝星状细胞株.

1.2.5 半定量RT-PCR测不同pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达质粒对COL1A1的影响: 细胞总RNA提取按TRIzol操作说明书进行, COL1A1 mRNA和β-actin的引物用引物设计软件Primer Premier5.0设计, 其中β-actin为内参照. 引物由上海闪晶生物技术有限公司合成, 分别为Col1a1 F: CATAAAGGGTCATCGTGGC Col1a1 R:TCAGGCTCTTGAGGGTAGTGT; β-Actin-F: 5-TGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3 β-Actin-R: 5-CAGTGGTACGACCAGAGGCA-3. 根据一步法RT-PCR试剂盒说明检测COL1A1. 并摄影后应用计算机图像分析系统行灰度扫描. 以与β-actin的PCR产物DNA条带灰度值之比(COL1A1/β-actin)作为反映COL1A1 mRNA水平的相对指标, 计算抑制率. 抑制率的计算为: 以条带灰度代表DNA的含量. 干扰载体对COL1A1 mRNA表达的抑制率采用下式计算: 抑制率(%) = (1-A1×A2c/A1c×A2)×100. A1: 转染干扰载体细胞的COL1A1 mRNA含量; A2: 转染干扰载体细胞的β-actin mRNA的含量; A1c: 转染shRNA-N细胞的COL1A1 mRNA含量. A2c: 转染shRNA-N载体细胞β-actin mRNA含量.

统计学处理 实验数据以mean±SD表示, 采用SPSS.13软件分析数据, 组间比较采用多组单因素方差分析(ANOVA), P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 质粒酶切鉴定

限制性内切酶PstⅠ酶和BamHⅠ双酶切质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA(图1A), 然后各取5 μL酶切产物在10 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(图1B-C). 图1B中M为l amda/E.co130Ⅰ; 左侧为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A (1-6)和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B(1-6)PstⅠ酶切结果; 其右侧为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B(1-6)BamHⅠ酶切结果. 图1C中M为lamda/E.co130Ⅰ; 左侧为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C(1-6)和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N(1-6)PstⅠ酶切结果; 其右侧为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C(1-6)和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N(1-6)BamHⅠ酶切结果.

图1 质粒酶切鉴定. A: pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体结构结构示意图; B-C: 重组载体的酶切鉴定.

2.2 重组质粒的DNA测序鉴定和细胞转染效率测定

重组质粒经自动基因测序仪测序(上海英骏生物技术有限公司). 结果与设计序列完全相符, 所含目的基因序列准确无误, 重组质粒构建成功. 真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA带有一突变的绿色荧光蛋白的报告基因, 能发出高亮度的绿色荧光, 应用流式细胞仪分析转染效率显示, 1、2、3、4 μg不同量的DNA质粒转染效率分别为16.7%±1%、20.3%±2%、23.5%±2%、22.3%±3%, 以2 μg为最佳剂量.

2.3 稳定转染的细胞株中COL1A1 mRNA表达的检测

半定量RT-PCR检测HSC内COL1A1 mRNA水平, 结果显示空白组和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N无显著差异(P>0.05), pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、B、C、N各组之间均有显著性差异(P<0.001, 表1, 图2).

表1 shRNA质粒干扰COL1A1-mRNA表达变化(目的基因/β-actin灰度比)和抑制率.

分组	灰度比	抑制率(%)
空白组	0.91±0.03	0.10±0.10
pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N	0.90±0.03	0.00±0.03
pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A	0.75±0.05	16.6±0.40
pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B	0.33±0.04	63.3±0.30
pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C	0.18±0.06	80.3±0.60

图2 半定量RT-PCR检测COL1A1 mRNA水平. M: DNA2000 marker; 1: 空白组; 2: pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N; 3: pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A;4: pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B; 5: pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C.

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变, 其本质是以胶原为主的ECM合成增多, 而降解相对减少, 两者失去动态平衡, 致使过多ECM沉积于肝内[6]. 研究表明ECM中主要成分是胶原, 正常肝脏胶原蛋白占总蛋白5%-10%, 其中Ⅰ型胶原蛋白占总胶原蛋白的40%-50%, Ⅲ型胶原蛋白占总胶原蛋白的40%-50%, 肝纤维化时胶原蛋白可占总蛋白的50%甚至更多, 其中Ⅰ型胶原蛋白占总胶原蛋白升至60%-70%, Ⅲ型胶原蛋白降至20%-30%. 可见肝纤维化时主要是肝脏中Ⅰ型胶原过度增加的结果. 进一步研究发现HSC合成分泌Ⅰ型胶原为主, 且整个肝脏胶原合成的数量以HSC合成的胶原为主, 现已证明HSC激活是产生Ⅰ型胶原导致纤维化发生发展的中心环节, 与肝脏内细胞, 基质, 介质相互作用构成了复杂的网络系统, 造成肝纤维化的发生发展[7-11]. 理论上,如果设法能阻断HSC中α1(Ⅰ)链的合成, HSC中缺少α1(Ⅰ)链, 而不能和α2(Ⅰ)链结合产生前Ⅰ型胶原, 从而达到减少Ⅰ型胶原合成的目的, 有效阻止肝纤维化进展.

RNAi作为一种新型的基因研究手段和治疗手段, 逐渐被广泛应用到生命科学当中. 在肝纤维化基因研究和治疗中, Kim et al[12]利用以质粒为载体的TGF-β1 siRNA注入到CCl₄肝纤维化大鼠体内, 结果发现Ⅰ型胶原蛋白和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)表达水平下降, 肝脏损害减轻. 我们可以看出RNA干扰对于肝纤维化治疗是一个很好的策略. 由于RNAi具有高度特异性、高效性、高成功率和模板选择性、效果可预测并且迅速、经济, 具有良好的应用前景. 有效的基因沉默, 需要设计和筛选特异、高效的靶基因RNAi序列, 以及通过有效方法把有效序列导入目的细胞是RNA干扰试验成功的关键[13-15]. 我们在设计RNA干扰有效序列是通过计算机网络进行第一步设计, 然后根据Tuschl新算法的设计原则既(N4)A(N6)T(N2)H(N5)W(N2), 其中N为任意核苷酸, A为腺嘌呤, T为胸腺嘧啶, H为不是鸟嘌呤, W为是A而不是G或C(胞嘧啶), 选取和上述原则相近的序列, 排除偏靶(off-target)效应, 最终筛选出3条理论上最佳的序列, 结果和原则最为相近的序列沉默效果最好, 而其他较差, 考虑和序列作用靶点有关[16-21]. 通过实验我们可以看到结合多种筛选方式选择有效序列, 能大大提高筛选成功率, 节约实验成本, 节省实验时间. 将siRNAs转入细胞是RNA干扰关键技术之一, 常规方法有: 脂质体转染、电穿孔法、微注射法[22-24]. 电穿孔法和微注射法操作复杂, 并且细胞死亡率较高, 而且需要较好的设备, 虽然脂质体(本课题使用Lipfectamine^TM 2000)转染试剂介导的转染, 操作简单, 而且不需要复杂的设备, 可以直接转染小的siRNA, 又可以转染质粒DNA, 且适合多种细胞类型使用, 但也存在对于不同细胞转染效率不一, 本课题转染细胞株效率不高, 进行G418稳定筛选, 工作量加大, 实验成本增加. 因此进一步研究高效导入HSC工具, 是十分必要的, 近年来相关实验, 应用腺相关病毒和慢病毒作为载体越来越多, 但腺病毒的免疫效应需进一步改善, 而以慢病毒为载体, 目的片段被整合到基因组当中, 这是否造成肿瘤的发生需要进一步研究[25-27].

总之, 本实验的siRNA设计是成功的, 除pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A抑制无明显效果外, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C均产生了很好的抑制效果, 在COL1A1 mRNA水平均能较显著抑制COL1A1的表达, 而且设计的shRNA-C靶点抑制效率达到80.3%, 表明我们筛选出了具有高效沉默COL1A1的小干扰RNA表达质粒, 为深入研究肝纤维化的RNAi靶向基因治疗体内实验奠定了基础.

评论

背景资料

肝纤维化发生机制是肝损害持续存在, 机体发生的修复反应, 造成细胞外基质合成, 降解与沉积不平衡的病理过程, 而胶原是细胞外基质得主要成分, 其中尤以Ⅰ型胶原, 如果能减少其合成, 就能延缓肝纤维化向肝硬化的转变. RNAi技术是一种新型发展起来的技术手段, 能高效、特异地阻抑细胞内源或外源性靶基因的表达.

同行评议者

冯志杰, 主任医师, 河北医科大学第二医院消化内科.

相关报道

有报道经门静脉注射肝纤维化大鼠CTGF siRNA发现, 治疗组大鼠肝组织CTGF mRNA及蛋白表达显著下调, 肝组织炎症、坏死及纤维化显著减轻. Kim et al将TGFβ1 siRNA用于CCl₄肝损伤大鼠模型同样发现, 肝脏表达TGFβ1、β-SMA、Ⅰ型胶原含量均明显下降.

创新盘点

本研究通过RNA干扰的方法抑制大鼠肝星状细胞COL1A1 mRNA的表达, 从而减少Ⅰ型胶原的合成.

应用要点

利用RNA干扰抑制COL1A1 mRNA的表达, 为进一步治疗肝脏纤维化提供了方法和途径.

同行评价

本文选材新颖, 技术先进, 论据充分, 国内外相关报道较少, 有一定的应用价值.

备注

编辑:程剑侠 电编:郭海丽

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