基础研究
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世界华人消化杂志. 2008-05-28; 16(15): 1622-1627
Published online 2008-05-28. doi: 10.11569/wcjd.v16.i15.1622
COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选
芦军, 赵金满, 孟艳, 余永红
芦军, 赵金满, 孟艳, 余永红, 中国医科大学第一附属医院消化内科 辽宁省沈阳市 110001
芦军, 硕士, 主要从事肝硬化的临床研究.
基金项目: 辽宁省教育厅高等学校科学技术基金资助项目, No. 05L452.
作者贡献分布: 赵金满与芦军对此文所作贡献均等; 此课题由赵金满与芦军设计; 研究过程由芦军, 孟艳及余永红操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由赵金满提供; 数据分析由芦军, 孟艳及余永红完成; 本论文写作由芦军完成; 赵金满修改校正.
通讯作者: 赵金满, 110001, 辽宁省沈阳市和平区南京北街155号, 中国医科大学第一附属医院消化内科. jinmanzhao@163.com
电话: 024-23268744
收稿日期: 2008-01-08
修回日期: 2008-03-19
接受日期: 2008-05-20
在线出版日期: 2008-05-28
Abstract

目的: 构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA (shRNA)的表达质粒.

方法: 从NCBI网站获得大鼠的COL1A1 cDNA序列, 根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列, 相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中, 即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C. 为得到高效沉默COL1A1-siRNA, 以脂质体LipofectAMINE2000, 将1、2、3、4 μg DNA质粒转染至HSC-T6细胞中, 并观察转染效果. 将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞, RT-PCR分析各组的COL1A1 mRNA表达水平.

结果: 靶向COL1A1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析, shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 经酶切凝胶电泳证实载体构建成功. 1、2、3、4 μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%, 以2 μg siRNA为最佳剂量, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%, 63.3%和80.3%.

结论: 筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1 mRNA的表达, 从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.

Keywords: 前Ⅰ型胶原α1链; 肝星状细胞; RNA干扰; 质粒; 逆转录-聚合酶链反应