修回日期: 2007-01-13
接受日期: 2007-01-20
在线出版日期: 2007-03-18
目的: 探对志贺菌敏感株与基因转移耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较, 寻找细菌耐多药相关蛋白.
方法: 采用接合基因转移实验对临床分离鉴定志贺菌敏感株进行基因转移耐多药试验, 并对志贺菌敏感株及基因转移耐多药株全菌蛋白进行双向电泳; 电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析, 并对差异表达蛋白进行MOLDI TOF-TOF质谱分析.
结果: 成功获得志贺菌基因转移耐多药株, 在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出946±37个和1013±157个蛋白质斑点; 经分析共发现43个差异表达的蛋白点, 初步对其中5个表达量增加的差异蛋白进行质谱鉴定, 基因转移耐多药株中发现两个新出现的耐多药相关蛋白分别为CRISPR相关蛋白及Hsp60的分子伴侣蛋白(Groel-Groes-Adp7); ABC转运蛋白、胱氨酸合成酶、预测的胞浆脂蛋白表达量上调.
结论: 通过对鉴定的5个耐多药相关蛋白分析初步发现供体菌中一些耐多药相关基因通过基因转移方式插入志贺菌敏感株中并大量表达, 同时一些在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调, ABC转运蛋白在志贺菌基因转移耐多药机制中也起重要作用.
引文著录: 宋春花, 黄志刚, 郗园林, 张梅喜, 段广才. 志贺菌基因转移耐多药相关蛋白初步分析. 世界华人消化杂志 2007; 15(8): 838-843
Revised: January 13, 2007
Accepted: January 20, 2007
Published online: March 18, 2007
AIM: To search for the new proteins related to multidrug resistance by comparing the proteomics of whole cellular proteins between sensitive strain and conjugational transfer anti-multidrug strain of Shigella flexneri.
METHODS: Clinical sensitive Shigella flexneri strain was transduced into anti-multidrug strain by conjugational transfer trials. Immobilized pH gradient (IPG) two-dimensional electrophoresis was adopted and the gels were analyzed by Image Master 2D Platinum software. Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) were used to analyzed differential expression proteins.
RESULTS: Conjugational transfer anti-multidrug strain of Shigella flexneri was obtained successfully. It was found that there were 946±37 protein spots in the whole cellular protein 2-DE gels of sensitive strain and 1013±157 protein spots in that of conjugational transfer anti-multidrug strain. A total of 43 differential expression protein spots were found and 5 proteins related to multidrug resistance, including two new proteins (CRISPR-associated protein and heat shock protein chaperone Groel-Groes-Adp7), were identified based on peptide mass fingerprinting. ATP binding cassette transporter protein, cysteine synthase, predicted periplasmic or secreted lipoprotein protein were highly expressed in conjugational transfer anti-multidrug strain.
CONCLUSION: Some genes related to multidrug resistance of the donor can be transduced into sensitive strains and expressed highly. Meanwhile, the expression of some important cellular metabolic enzymes is up-regulated, and ATP binding cassette transporter protein plays an significant role in the mechanism of Shigella flexneri multidrug resistance.
- Citation: Song CH, Huang ZG, Xi YL, Zhang MX, Duan GC. Primary analysis on conjugational transfer multidrug resistance-related proteins of Shigella flexneri strain. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(8): 838-843
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i8/838.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i8.838
志贺菌引起的细菌性痢疾发病率居我国传染病发病率的前3位, 近年来随着抗生素的广泛使用, 甚至滥用, 造成志贺菌频繁发生变异产生耐药株, 且耐药率高、耐药产生速度快、耐药范围广, 不断给细菌性痢疾的防治带来新的挑战, 1996年痢疾志贺菌被WHO认定为给人类带来巨大威胁的耐药性菌株, 因此深入探讨志贺菌的耐多药机制成为目前解决志贺菌耐多药的先决条件. 本课题拟选用对抗生素敏感的一株志贺菌为受体菌, 以一株耐多药埃希氏大肠杆菌为供体菌, 以接合转移方式构建出耐多药菌株, 通过比较敏感株与基因转移耐多药株蛋白质双向电泳图谱, 研究与志贺菌耐多药相关蛋白, 并对表达差异蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MOLDI TOF-TOF)分析和数据库检索, 旨在探索其耐多药机制.
1.1.1 菌株: (1)标准株: 福氏痢疾杆菌标准株, 菌株号51571-9(中国药品生物制品检定所); (2)敏感株及耐多药埃希氏大肠杆菌: 采用改良K-B纸片法[1], 从临床分离鉴定的志贺菌株中, 筛选1株对头孢噻吩(cephalothin, CF)、诺氟沙星(norfloxacin, NOR)、庆大霉素(gentamycin, GM)、磺胺甲基异恶唑(cotrimoxazole, SMZ)均敏感的福氏志贺菌作为敏感株; 对以上4种抗生素均耐药的致病性大肠杆菌为接合基因转移实验的供体菌, 标准株作对照.
1.1.2 试剂与仪器: 头孢噻吩等抗生素均为标准品(中国药品检验中心). 固相pH梯度干胶条(immobiline pH gradient, IPG, pH3-10, L = 24 cm); IPG缓冲液、IPG覆盖液、两性电解质pharmalyte(pH3-10)、3-[(3-胆酰胺丙基)-乙二胺]-1-丙磺酸[3-(3-cholamidopropyl- dimethylammonio)-1-propanesulfonate, CHAPS] (Amersham Pharmacia公司). 丙烯酰胺、尿素(urea)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、蛋白酶抑制剂丙甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)(美国Sigma公司). 固相pH梯度等电聚焦仪IPGphor IEF System, 垂直板电泳仪、ImageScanner光密度扫描仪、图像分析系统(均为AmershamPharmacia公司).
1.2.1 志贺菌敏感株与耐多药大肠埃希菌接合转移实验: 将志贺菌敏感株作为受体菌, 耐多药大肠埃希菌作为供体菌, 参照文献2的方案进行, 将供、受体菌分别接种于4 mL LB肉汤37 ℃过夜, 后按10:1比例混合培养过夜. 吸取0.1 mL涂布于含约4倍最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的CF, NOR, GM, SMX的S.S.琼脂, 取无色透明菌落在相同琼脂上传代一次, 再于普通琼脂上活化后测其耐药谱.
1.2.2 蛋白质双向电泳: (1)蛋白提取方法: 采用超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法[3], 略作改进; (2)可溶性总蛋白定量: 应用BradFord法[4]对提取的可溶性总蛋白进行定量; (3)第一相固相pH梯度等电聚焦: 按文献[5]的方案, 程序分别为30 V 7 h, 60 V 7 h, 150 V 0.5 h, 300 V 1 h, 600 V 1 h, 8000 V 12 h; (4)平衡: 按文献[5]的方案; (5)第二相垂直板SDS-PAGE电泳: 按文献[3]的方案; (6)染色: 银染按Amersham Bioscience的银染方案稍作改进[5]. 考马斯亮蓝染色按Neuhoff et al[6]的方法进行; (7)图像扫描分析: 用Amersham Bioscience的扫描仪投射扫描, 分辨率为300 dpi. 数字化图像文件运用Image Master 2D Platinum软件分析. 图像分析过程包括蛋白质斑点的检测、量化、背景扣除、匹配. 蛋白质斑点经自动检测后进行手工校对, 匹配之前先选一块胶作为参考凝胶, 其他凝胶都与之匹配.
1.2.3 质谱分析: (1)质谱样品制备: 比较双向电泳图谱, 找到差异蛋白, 切下1 mm3含差异蛋白点的凝胶, 置于1. 5 mL的Eppendorf管中, 按文献[7]方法处理样品; (2)质谱鉴定: 样品按照1:1的比例, 与含有a-氰基-羟基苯丙烯酸的500 g/L乙腈/1 g/L甲酸的溶液混合. 所有质谱在4700型MALDI TOF-TOF蛋白质分析系统下获得. 选择反射式阳离子捕获方式, 质量精确度为50 mg/L; MS光谱质量范围800-4000 Da.
1.2.4 数据库检索: 光谱在全球蛋白服务工作站(global protein server workstation, GPS)进行处理和分析; 搜索在NCBInr蛋白数据库进行; 鉴定GPS可信区间应>95%. 搜索参数设置: 相对分子质量误差范围为±20%, 肽片段相对分子质量误差范围为±0.5 Da, 每个肽允许有1个不完全裂解位点, 物种选择细菌; 蛋白质身份确定: 根据搜索结果并结合蛋白质在凝胶上的等电点和相对分子质量进行最终确定; 要求肽段覆盖率>15%, 匹配肽段至少4个, 等电点和相对分子质量与观察值基本相符.
志贺菌出发菌株的MIC分别为头孢噻吩(CF) 32 mg/L、诺氟沙星(NOR)0.5 mg/L、庆大霉素(GM)2 mg/L、磺胺甲基异恶唑(SMZ)512 mg/L, 经与耐多药大肠杆菌接合转移实验后, MIC分别是头孢噻吩256 mg/L、诺氟沙星4.0 mg/L、庆大霉素20 mg/L、磺胺甲基异恶唑5120 mg/L的基因转移耐多药志贺菌. 将基因转移后耐多药的志贺菌作药敏试验, 结果4种药物的抑菌环直径均为0 cm(标准株主要用于在药敏实验时的质控菌, 故其结果未在此列出).
(1)敏感株: 相同实验条件及参数设置情况下, 对志贺菌可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离, 发现3次双向电泳图谱非常相似, 蛋白质上样量为100 mg, pH3-10, 24 cm线性干胶条通过Image Master 2D Platinum分析软件对其进行点检测, 获得946±37个蛋白质斑点(图1A); (2)志贺菌基因转移耐多药株: 对志贺菌基因转移耐多药株可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离, 获得3块凝胶的平均蛋白质点数为1013±157(图1B). 经过背景消减后, 将其中一块胶作为参考凝胶进行匹配, 匹配点数为998±24, 其匹配率为98.52%.
以基因转移耐多药株双向凝胶图谱为参考凝胶, 与敏感株双向凝胶图谱进行匹配, 匹配蛋白质点数为640±19, 匹配率为65.12%, 共发现43个差异表达的蛋白点, 其中8个蛋白点只存在于基因转移耐多药株中, 6个蛋白点只存在于敏感株中, 还有29个蛋白点在两株菌株中表达量相差5倍以上, 其中22个蛋白点随着志贺菌由敏感株向耐多药株转变而表达量增加, 7个蛋白点表达量下降(图2, 图3).
在考马斯亮蓝染色的凝胶上选取5个在基因转移耐多药株表达量增加的差异点进行肽指纹图谱鉴定, 其中Z202和Z204为新出现蛋白, Z200, Z201及Z98号点表达量增加(表1).
| 蛋白序号 | SWISS-PROT登陆序列号 | 最高分 | 分子量等电点 | 序列覆盖率(%) | 蛋白质(分类) |
| Z98 | NCBInIr gi|75242664 | 178 | 592555.96 | 30 | ABC-type dipeptide transport system, periplasmic (Escherichia coli F11) |
| Z204 | NCBInr gi|76795666 | 80 | 349065.23 | 29 | CRISPR-associated protein TM1801 [Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC 33223] |
| Z202 | NCBInr gi|61679964 | 211 | 551244.87 | 49 | Chain N, Groel-Groes-Adp7 (Escherichia coli) |
| Z200 | NCBInr gi|75187168 | 209 | 344845.83 | 71 | Cysteine synthase [Escherichia coli E24377A] |
| Z201 | NCBInr gi|75176024, | 84 | 193885.43 | 42 | Predicted periplasmic or secreted lipoprotein [Shigellaboydii BS512] |
Liao et al[8]曾对志贺菌标准株作过全菌蛋白质双向电泳, 共得到488的个蛋白质点, Ying et al[9]及Jennison et al[10]也分别对其外膜蛋白进行双向电泳, 但临床分离志贺菌全菌蛋白质双向电泳图谱尚无文献报导, 本研究成功构建了志贺菌的全菌蛋白图谱, 由于我们改进了全菌蛋白提取方法及电泳染色方案, 分别获得946及1013个蛋白质斑点, 远高于Liao et al[8]报导的488个蛋白质斑点.
Jansen et al[11]于2002年发现一个新的主要在原核细胞中出现的规律的成簇插入的DNA重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR), 片段大小约为21-37 bp, 此可移动重复序列与先前在细菌与古细菌之间发现的横向基因转移成分[12]一样, 存在于半数以上的原核生物基因组中, 在基因组上大多有两个以上CRISPR位点, 这些CRISPR与DNA的新陈代谢及基因的表达有关[11]. CRISPR作为细胞中的可移动序列, 其表达的蛋白质家族能够形成保守的蛋白簇[13], 在宿主的防御机制[14-15]、基因复制及调节系统中[16-17]起重要作用. 本研究通过对敏感株与基因转移耐多药株双向电泳图谱分析发现, CRISPR相关蛋白为在基因转移耐多药株中新出现蛋白, 可见此短片段DNA重复序列是在基因转移耐多药过程中从供体菌转移入受体菌中, 并在受体菌中表达, 可能为一种新的耐多药相关蛋白, 推测其在耐多药机制中起调节作用, 能增强一些耐多药基因的表达, 从而导致细菌出现耐多药.
Z202号蛋白Hsp60的分子伴侣蛋白(Groel-Groes-Adp7): 分子伴侣蛋白为在生物大分子的折叠、组装、转运及降解等过程中起协助作用, 参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立; 参与细胞周期调控、抗衰老、凋亡调控等, 但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子[18]. Hartl et al[19]研究发现, 分子伴侣与新生肽链结合, 阻止新生肽链折叠成天然构象或聚集, 使其保持能够跨膜转运出去的分子构像, 利于跨膜转运. 我国杨运桂et al[20]研究发现, 在过量表达GroEL的宿主菌中, 周质分泌蛋白总量较对照组提高了约52%, 同时也增加了靶蛋白的溶解性. 在本次研究中, 我们发现, 出发菌株志贺菌敏感株并未分离出此蛋白, 但经与耐多药大肠杆菌接合基因转移后, 此蛋白不但出现, 而且表达量很高, 推测在大剂量药物冲击这个应激条件刺激下, 首先编码GroEL的基因通过接合基因转移整合入志贺菌敏感株基因组中, 或通过质粒传递进入敏感株中, 并且在新宿主菌中大量表达, 防止新生的耐多药相关蛋白质发生聚集或折叠, 保证他们的正确构象, 增强耐多药相关蛋白质活性, 籍此适应新的宿主环境.
ABC外排系统为细菌多重耐药主动流出机制之一, 肿瘤细胞膜上此蛋白过量表达, 以便药物顺利进入细胞也会很快被泵出, 形成多样抗药性[21-23]. Jessup et al[24]发现, ABC转运系统可以把胆固醇从巨噬细胞中排出, 陈川et al[25]在研究嗜水气单胞菌耐四环素的蛋白质组学时发现ABC转运蛋白在耐药株中表达量显著增加, Loiseau et al[26]发现, ABC转运系统在利什曼原虫的抗药性中起重要作用. Sipos et al[27]也发现, ABC转运子在真菌的多药耐受性中起重要作用. 此前我们关于志贺菌多重耐药机制研究发现另一主动外排系统acrAB-tolC多重耐药泵在临床多重耐药志贺菌中广泛存在[28], 本文结果显示, 98号ABC转运蛋白(ATP binding cassette transporter protein)在志贺菌基因转移耐多药株中表达量上调, 表明虽然ABC转运蛋白也存在于志贺菌敏感株中, 但在志贺菌基因转移耐多药株中表达量明显增加, 将结构不同药物泵出胞外, 导致胞内药物达不到有效浓度而导致细菌耐多药, 可见此蛋白在志贺菌的耐多药机制中也起重要作用.
我们发现, 在接合转移耐多药株中Z200号胱氨酸合成酶(cysteine synthase)表达量显著增加: 胱氨酸合成酶是生物体内合成胱氨酸的主要酶, 有研究表明枯草芽孢杆菌胱氨酸合成酶是与硫同化相关基因表达的一个通用负调控子[29], 但胱氨酸合成酶在志贺菌耐多药中的作用机制尚无报导, 推测此酶在耐多药机制中起着调控子的作用. 质谱分析结果表明201号蛋白为一种预测的胞质脂蛋白, 分子量较小为19388 Da, 在接合转移株表达量显著增加, 说明此胞质脂蛋白在志贺菌接合转移耐多药中起一定作用, 可能与药物的转运及多重耐药信号的传导有关, 但其与耐多药相关功能尚需进一步作N端或C端测序.
本文从全蛋白组角度探讨志贺菌的基因转移耐多药机制, 并且在实验中使用一株出发菌株通过基因转移产生耐多药, 排除菌株不同而导致的差异, 可比性较高. 我们的后续研究将会发现更多与志贺菌基因转移耐多药相关蛋白, 从而为志贺菌耐多药分子机制及新型抗菌药物开发研制提供基础资料.
近年来, 随着抗生素的广泛使用, 甚至滥用, 造成志贺菌频繁发生变异产生耐药株, 不断给细菌性痢疾的防治带来新的挑战.1996年痢疾志贺菌被WHO认定为给人类带来巨大威胁的耐药性菌株, 因此深入探讨志贺菌的耐多药机制成为目前解决志贺菌耐多药的先决条件. 目前, 在向功能基因组学研究过渡中, 蛋白质组学研究成为一种非常有用的工具, 其是解析基因组所表达的真正体现生命活动规律的蛋白质的结构和功能.
细菌产生耐药性不仅可以水平传播, 也可以自身诱导产生, 尤其是细菌的耐多药. 细菌耐多药是多基因、多蛋白参与的一个复杂过程, 而目前的研究多局限于某一机制的个别基因及蛋白, 不但难以解释细菌耐多药的全部现象, 更不能全面揭示细菌耐多药的分子基础及机制. 因此, 细菌的耐药机制亟待解决.
Liaoetal曾对志贺菌标准株作过全菌蛋白质双向电泳, 共得到488的个蛋白质点. 在研究细菌耐多药机制方面, 陈川etal在研究嗜水气单胞菌耐四环素的蛋白质组学时发现, ABC转运蛋白在耐药株中表达量显著增加, CRISPR作为细胞中的可移动序列, 其表达的蛋白质家族能够形成保守的蛋白簇, 在宿主的防御机制、基因复制及调节系统中起重要作用.
从全蛋白组出发, 较全面深入揭示志贺菌耐多药的分子基础, 首次构建来自同一临床分离志贺菌敏感株的基因转移耐多药株, 排除了非同源差异. 通过本项研究, 初步获得志贺菌基因转移耐多药机制的部分相关蛋白质, 其中有一些可能为新发现的耐多药相关蛋白.
通过本项研究, 可以同时获得志贺菌基因转移耐多药机制的相关蛋白质, 对阐明细菌耐多药的分子机制、进行耐药监测及控制、开展药物研制都具有重要价值.
本文初步分析了志贺菌基因转移耐多药相关蛋白, 文章撰写较流畅, 目的明确, 具有一定的指导意义.
编辑:王晓瑜 电编:李琪
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