研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2007-06-28; 15(18): 2046-2049
在线出版日期: 2007-06-28. doi: 10.11569/wcjd.v15.i18.2046
罗格列酮对小鼠日本血吸虫病肝纤维化基质金属蛋白酶-2的影响
谌辉, 张景辉, 刘文琪, 贺永文
谌辉, 贺永文, 华中科技大学同济医学院附属协和医院传染科 湖北省武汉市 430030
张景辉, 华中科技大学同济医学院附属协和医院外科实验室 湖北省武汉市 430030
刘文琪, 华中科技大学同济医学院寄生虫学教研室 湖北省武汉市 430022
基金项目: 湖北省自然科学基金, No. 2005ABA170.
通讯作者: 谌辉, 430030, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属协和医院传染科. chenhui0515@yahoo.com.cn
电话: 027-85726132
收稿日期: 2007-03-23
修回日期: 2007-05-01
接受日期: 2007-05-11
在线出版日期: 2007-06-28

目的: 研究PPARγ配体罗格列酮治疗小鼠血吸虫病肝纤维化, 血清MMP-2与TIMP-2的变化及肝组织MMP-2与TIMP-2的基因表达.

方法: 昆明小鼠50只, 随机分为正常对照组A、感染对照组B、吡喹酮治疗组C、罗格列酮治疗组D及罗格列酮加吡喹酮治疗组E. 除正常对照组外, 其余各组均建立血吸虫病肝纤维化小鼠模型. 用ELISA法检测血清MMP-2及TIMP-2的含量, 实时荧光定量PCR反应观察小鼠肝组织MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA的表达.

结果: D, E组血清MMP-2的含量(306.0±62.3 mg/L, 312.0±54.3 mg/L)及肝组织MMP-2 mRNA的表达[-19.1±(-6.0), -20.4±(-6.2)]高于A组[221.3±39.2 mg/L, -26.3±(-5.3); P<0.05], 但明显低于B组[411.3±57.5 mg/L, -12.2±(-4.4), P<0.05]和C组[402.9±57.2 mg/L, -12.8±(-4.0), P<0.05]. B, C, D和E组血清TIMP-2的含量及肝组织TIMP-2 mRNA的表达均显著高于正常对照组[209.3±60.5 mg/L, -20.5±(-4.7); 213.5±66.0 mg/L, -19.9±(-5.1); 223.6±65.3 mg/L, -18.8±(-5.5); 224.5±64.4 mg/L, -19.7±(-4.3) vs 150.4±46.5 mg/L, -27.2±(-6.0), P<0.05], 但这4组间TIMP-2值无显著性差异(P>0.05).

结论: MMP-2在血吸虫病肝纤维化形成中起促进作用, PPARγ配体罗格列酮的抗肝纤维化机制与其下调MMP-2的表达有一定关系.

关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体γ; 肝纤维化; MMP-2; TIMP-2
引文著录: 谌辉, 张景辉, 刘文琪, 贺永文. 罗格列酮对小鼠日本血吸虫病肝纤维化基质金属蛋白酶-2的影响. 世界华人消化杂志 2007; 15(18): 2046-2049
Effects of rosiglitazone on matrix metalloproteinase-2 in mice with schistosomiasis and liver fibrosis
Hui Chen, Jing-Hui Zhang, Wen-Qi Liu, Yong-Wen He
Hui Chen, Yong-Wen He, Department of Infectious Disease, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Jing-Hui Zhang, Department of Surgical Laboratory, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Wen-Qi Liu, Department of Parasitology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Supported by: The Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2005ABA170.
Correspondence to: Hui Chen, Department of Infectious Disease, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China. chenhui0515@yahoo.com.cn
Received: March 23, 2007
Revised: May 1, 2007
Accepted: May 11, 2007
Published online: June 28, 2007

AIM: To study the effects of rosiglitazone, a peroxisome proliferator-activator receptor (gamma) ligand, on serum levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and the tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2), along with the hepatic expression of MMP-2 and TIMP-2 mRNA in mice with liver fibrosis caused by Schistosoma japonicum infection.

METHODS: Fifty mice were divided into five groups: one uninfected group (A), and four schistosomiasis groups (B-E): without any treatment (B), praziquantel treatment (C), rosiglitazone treatment (D), and rosiglitazone and praziquantel treatment (E). Serum levels of MMP-2 and TIMP-2 were measured by ELISA. Hepatic expression of MMP-2 and TIMP-2 mRNA were determined by real-time quantitative PCR.

RESULTS: Serum level and hepatic mRNA expression of MMP-2 were markedly higher in groups D and E [306.0 ± 62.3 mg/L, 312.0 ± 54.3 mg/L; -19.123 ± (-5.965), -20.375 ± (-6.189)] than in group A [221.3 ± 39.2 mg/L, -26.324 ± (-5.314); P < 0.05], but were lower than in group B [411.3 ± 57.5 mg/L, -12.227 ± (-4.426), P < 0.05] and group C [402.9 ± 57.2 mg/L, -12.804 ± (-4.036), P < 0.05]. Serum level and hepatic mRNA expression of TIMP-2 was markedly increased in the four schistosomiasis groups compared to the normal group [209.3 ± 60.5 mg/L, -20.516 ± (-4.716); 213.5 ± 66.0 mg/L, -19.944 ± (-5.052); 223.6 ± 65.3 mg/L, -18.767 ± (-5.509); 224.5 ± 64.4 mg/L, -19.676 ± (-4.320) vs 150.4 ± 46.5 mg/L, -27.186 ± (-5.985), P < 0.05]; however, there was no significant difference among the schistosomiasis groups (P > 0.05).

CONCLUSION: MMP-2 plays a role in promoting liver fibrosis. Rosiglitazone can relieve liver fibrosis because it down-regulates the expression of MMP-2 in mice with schistosomiasis and liver fibrosis.

Key Words: Peroxisome proliferator-activator receptor gamma; Fibrosis; Matrix metalloproteinase-2; Tissue inhibitor of metalloproteinase-2
0 引言

在肝纤维化形成过程中, 基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)的表达与活性增高[1]. 激活的MMP-2因能降解肝窦状隙内皮下正常基底膜基质而促使肝星状细胞(HSC)活化. 因而在肝纤维化的形成过程中起促进作用. 有文献报道过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activator receptors gamma, PPARγ)的配体, 有较好的抗肝纤维化作用[2]. 我们以往的研究也证实了这一点[3]. 但其具体机制尚不完全清楚, 我们研究PPARγ配体罗格列酮治疗小鼠血吸虫病肝纤维化, 血清MMP-2与基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2, TIMP-2)的变化及肝组织MMP-2与TIMP-2的基因表达, 探讨PPARγ配体抗血吸虫病肝纤维化的可能作用及机制.

1 材料和方法
1.1 材料

昆明小鼠50只, 体质量16-22 g, 购于华中科技大学同济医学院动物实验中心. 随机分为5组, 每组10只, 除正常对照组外, 模型组均经皮感染日本血吸虫尾蚴40条. 罗格列酮片为葛兰素史克有限公司产品. MMP-2及TIMP-2引物购自上海博亚生物技术有限公司, SYBR GreenⅠ荧光染料购自美国Biotium公司, TRIzol溶液购自美国Gibco公司. PCR仪: 上海枫岭生物技术有限公司生产的FTC-2000型实时荧光定量PCR仪.

1.2 方法

正常对照组: 常规喂养4 wk后灌服等量的生理盐水至10 wk末; 感染对照组: 感染尾蚴4 wk后灌服等量的生理盐水至10 wk末; 吡喹酮治疗组: 感染尾蚴4 wk后每天用吡喹酮500 mg/kg灌胃, 杀虫治疗2 d后改为等量的生理盐水灌胃治疗至10 wk末; 罗格列酮治疗组: 感染尾蚴4 wk后用每天罗格列酮4 mg/kg灌胃治疗至10 wk末; 罗格列酮加吡喹酮治疗组: 感染尾蚴4 wk后用吡喹酮灌胃(剂量同前)治疗2 d, 每天用罗格列酮4 mg/kg灌胃治疗至10 wk末. 最后断颈法处死小鼠, 取血清置于-20℃冰箱中保存待检, 取部分肝组织置液氮中保存备检.

1.2.1 血清MMP-2及TIMP-2检测: 采用ELISA方法, MMP-2及TIMP-2诊断试剂盒为美国R&D Systems公司产品.

1.2.2 肝组织MMP-2及TIMP-2表达: 每份标本取组织100 mg加入玻璃匀浆器中, 加入TRIzol溶液1 mL提取总RNA, 以总RNA为模板, 逆转录合成cDNA. 应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术行实时定量PCR反应, 以适量cDNA为模板, 以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照, PCR扩增MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA基因片段. MMP-2引物设计: MMP-2引物: 上游: 5'-TGGGTGGAAATTCAGAAGGTGC-3', 下游: 5'-ATCTACTTGCTGGACATCAGGGGG-3'. TIMP-2引物: 上游: 5'-GAGATCAAGCAGATAAAGATG-3', 下游: 5'-GACCCAGTCCATCCAGAGGC-3'. GAPDH引物: 上游: 5'-GAGCTCACCGGGTTGGTTTTG-3', 下游: 5'-TACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'. PCR反应参数: 预变性94℃ 5 min, 然后94℃变性30 s, 53℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共30个循环, 最后72℃延伸10 min. 在延伸的过程中搜集荧光信号. 于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照, 将PCR产物做熔解曲线, 65℃ Touch-Down PCR, 每个循环温度上升0.2℃, 150个循环, 证实以上PCR反应产物特异性良好. 计算方法: 待测样品相对值 = 2△△Ct; △△Ct = △Ct待测样品-△Ct β-actin; Ct = Ct阴性对照-Ct待测样品. 统计△△Ct值以比较各组MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA的表达.

统计学处理 采用SPSS11.5软件分析. 计量资料结果以mean±SD示, 采用方差分析, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 血清MMP-2和TIMP-2

感染对照组和吡喹酮治疗组血清MMP-2的含量显著高于正常对照组(P<0.05), 罗格列酮组及罗格列酮加吡喹酮组MMP-2的含量高于正常对照组, 但明显低于感染对照组和吡喹酮治疗组(P<0.05). 感染对照组, 吡喹酮治疗组, 罗格列酮组及罗格列酮加吡喹酮组血清TIMP-2的含量显著高于正常对照组(P<0.05), 但这4组间TIMP-2值无显著性差异(P>0.05)(表1).

表1 小鼠MMP-2和TIMP-2含量和MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达(mean±SD, n = 10).
分组血清(mg/L)
肝组织
MMP-2TIMP-2MMP-2 mRNATIMP-2 mRNA
正常对照221.3±39.2150.4±46.5-26.3±(-5.3)-27.2±(-6.0)
感染对照411.3±57.5a209.3±60.5a-12.2±(-4.4)a-20.5±(-4.7)a
吡喹酮402.9±57.2a213.5±66.0a-12.8±(-4.0)a-19.9±(-5.1)a
罗格列酮306.0±62.3ac223.6±65.3a-19.1±(-6.0)ac-18.8±(-5.5)a
罗格列酮加吡喹酮312.0±54.3ac224.5±64.4a-20.4±(-6.2)ac-19.7±(-4.3)a
aP<0.05 vs 正常对照组;
cP<0.05 vs 感染对照组和吡喹酮组.
2.2 肝组织MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA表达

感染对照组和吡喹酮治疗组肝组织MMP-2 mRNA的含量显著高于正常对照组(P<0.05), 罗格列酮组及罗格列酮加吡喹酮组MMP-2 mRNA的含量高于正常对照组, 但明显低于感染对照组(P<0.05). 感染对照组, 吡喹酮治疗组, 罗格列酮组及罗格列酮加吡喹酮组肝组织TIMP-2 mRNA的含量显著高于正常对照组(P<0.05). 这4组间TIMP-2 mRNA的表达无显著性差异(P>0.05)(表1).

3 讨论

肝细胞外基质(ECM)的合成与降解处于动态平衡之中, 各种病因引起肝细胞发生坏死和炎症刺激时, 导致ECM合成与降解平衡破坏, ECM合成增多和/或降解减少, 沉积在肝内引起肝纤维化[4]. MMPs是一组蛋白酶类, 具有降解ECM作用. 其活性受基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)调节[5]. TIMPs是MMPs活性组织抑制物, TIMPs与等比例的MMPs以非共价键可逆性结合形成复合体, 从而抑制MMPs的活性. 目前认为, 肝纤维化是一个可逆的动态过程, 该过程反映出ECM 代谢的变化, 而MMPs和TIMPs间的平衡决定了ECM的代谢. 因此, MMPs和TIMPs生成、活化及表达的变化是决定肝纤维化进展和消退的关键因素[6-7].

MMP-2又称Ⅳ型胶原酶, 能降解明胶和Ⅳ, Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ型基底膜胶原. 一旦激活, 即可降解细胞周围的基底膜成分如Ⅳ型胶原、层黏连蛋白等, 打破细胞与ECM之间正常的关系, 破坏维持HSC于静止状态所必须的基底膜样的基质环境, HSC会被激活并向成纤维细胞转化, 同时大量产生包括Ⅰ, Ⅲ型胶原在内的ECM, 促进肝纤维化的发生和发展[8]. MMP-2的表达与酶活性在肝纤维化的逆转过程中是逐渐降低的, 说明MMP-2与肝纤维化的发生、发展密切相关[9]. TIMP-2主要由肝细胞、HSC等产生, 可在原位抑制MMP-2活力, 使ECM降解减少[10]. MMP-2和TIMP-2的动态变化是决定肝纤维化的关键因素之一. PPARγ是一类由配体激活的核转录因子, 是重要的肝脏代谢功能调节分子, 其功能改变与一些肝脏疾病有相关性[11-13]. PPARγ及其配体在肝纤维化形成中的作用已引起人们的关注, 但其具体机制尚不完全清楚. 目前认为PPARγ配体作为PPARγ的激活剂, 可抑制肝星状细胞的增殖, 减少肝内胶原积聚和增加肝内胶原酶活性[14]. 但其对在肝纤维化形成中起作用的MMPs是否亦可发挥作用尚不清楚.

我们用日本血吸虫尾蚴感染小鼠建立肝纤维化模型, 并检测血清及肝组织MMP-2和TIMP-2的表达, 发现感染对照组血清MMP-2的含量及肝组织MMP-2 mRNA的表达显著高于正常对照组; IMP-2的含量及表达也较正常对照组升高, 但其表达相较于MMP-2过于低下. 从而使MMP-2的活性得不到抑制而增高, 促进了肝纤维化的形成与发展. 肝纤维化时, TIMP-2表达相对或绝对下调, 而MMP-2表达增多, 结果是除间质胶原外的大部分ECM可及时降解, 这也可能是肝硬化组织和正常肝组织ECM成分存在质和量的不同及组织结构不同的原因. 在肝纤维化早期采用PPARγ配体罗格列酮治疗, 观察血清及肝组织MMP-2和TIMP-2的表达. 发现罗格列酮治疗后MMP-2血清含量及肝组织mRNA表达较感染对照组明显降低, 而TIMP的血清含量及肝组织mRNA表达变化不大, 提示PPARγ配体罗格列酮可通过下调MMP-2的水平, 减轻MMP-2对肝脏正常基底膜的破坏, 从而间接抑制了HSC的激活, 阻止肝纤维化的发展.

一般说来, MMPs是以非活性的酶原形式分泌的, 然后再在细胞外激活, 因此, MMPs可以在血循环中检测到. 由于尚未发现外周血细胞有MMP2的表达, 故认为MMP2是肝脏特异的, 亦即血循环中MMP2水平与肝内MMP2表达密切相关[9]. 我们也发现, 血清MMP-2含量与肝组织MMP-2 mRNA表达基本一致. 本实验显示PPARγ配体罗格列酮的抗日本血吸虫病肝纤维化机制与其下调MMP-2的表达有一定关系.

评论
背景资料

PPARγ是一类由配体激活的核转录因子, 其功能改变与一些肝脏疾病有相关性. PPARγ与配体结合后被激活, 在肝纤维化形成中的作用已成为肝纤维化研究领域里的一个新热点. 我们在以往的研究中已证实PPARg配体罗格列酮有抗血吸虫病肝纤维化作用. 为进一步探讨其可能的作用机制, 本实验研究罗格列酮对血吸虫病肝纤维化基质金属蛋白酶-2的影响.

创新盘点

目前国内外尚未见PPARγ配体与血吸虫病肝纤维化的关系进行研究. 本文首次研究PPARγ配体对小鼠日本血吸虫病肝纤维化MMP-2及TIMP-2的影响.

应用要点

本实验显示PP-ARγ配体罗格列酮能下调日本血吸虫病肝纤维化MMP-2的表达, 为PPARγ配体与血吸虫病肝纤维化的关系提供新的依据.

同行评价

本文用PPARγ配体罗格列酮干预治疗肝纤维化动物模型, 结果显示罗格列酮抗日本血吸虫病肝纤维化机制与其下调MMP-2的表达有关. 文章设计合理, 有一定的参考价值.

编辑:程剑侠 电编:张敏

1.  Zhou X, Hovell CJ, Pawley S, Hutchings MI, Arthur MJ, Iredale JP, Benyon RC. Expression of matrix metalloproteinase-2 and -14 persists during early resolution of experimental liver fibrosis and might contribute to fibrolysis. Liver Int. 2004;24:492-501.  [PubMed]  [DOI]
2.  Lv P, Luo HS, Zhou XP, Chireyath Paul S, Xiao YJ, Si XM, Liu SQ. Thalidomide prevents rat liver cirrhosis via inhibition of oxidative stress. Pathol Res Pract. 2006;202:777-788.  [PubMed]  [DOI]
3.  谌 辉, 张 景辉, 刘 文琪, 贺 永文. 罗格列酮对日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织核因子-κB和过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响. 世界华人消化杂志. 2007;15:741-745.  [PubMed]  [DOI]
4.  Kershenobich Stalnikowitz D, Weissbrod AB. Liver fibrosis and inflammation. A review. Ann Hepatol. 2003;2:159-163.  [PubMed]  [DOI]
5.  Skiles JW, Gonnella NC, Jeng AY. The design, structure, and clinical update of small molecular weight matrix metalloproteinase inhibitors. Curr Med Chem. 2004;11:2911-2977.  [PubMed]  [DOI]
6.  Roderfeld M, Hemmann S, Roeb E. Mechanisms of fibrinolysis in chronic liver injury (with special emphasis on MMPs and TIMPs). Z Gastroenterol. 2007;45:25-33.  [PubMed]  [DOI]
7.  Xu GF, Li PT, Wang XY, Jia X, Tian DL, Jiang LD, Yang JX. Dynamic changes in the expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors, TIMPs, during hepatic fibrosis induced by alcohol in rats. World J Gastroenterol. 2004;10:3621-3627.  [PubMed]  [DOI]
8.  Yang C, Zeisberg M, Mosterman B, Sudhakar A, Yerramalla U, Holthaus K, Xu L, Eng F, Afdhal N, Kalluri R. Liver fibrosis: insights into migration of hepatic stellate cells in response to extracellular matrix and growth factors. Gastroenterology. 2003;124:147-159.  [PubMed]  [DOI]
9.  El-Gindy I, El Rahman AT, El-Alim MA, Zaki SS. Diagnostic potential of serum matrix metalloprotei-nase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 as non-invasive markers of hepatic fibrosis in patients with HCV related chronic liver disease. Egypt J Immunol. 2003;10:27-35.  [PubMed]  [DOI]
10.  Nie QH, Duan GR, Luo XD, Xie YM, Luo H, Zhou YX, Pan BR. Expression of TIMP-1 and TIMP-2 in rats with hepatic fibrosis. World J Gastroenterol. 2004;10:86-90.  [PubMed]  [DOI]
11.  Inoue M, Ohtake T, Motomura W, Takahashi N, Hosoki Y, Miyoshi S, Suzuki Y, Saito H, Kohgo Y, Okumura T. Increased expression of PPARgamma in high fat diet-induced liver steatosis in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2005;336:215-222.  [PubMed]  [DOI]
12.  Berkenstam A, Gustafsson JA. Nuclear receptors and their relevance to diseases related to lipid metabolism. Curr Opin Pharmacol. 2005;5:171-176.  [PubMed]  [DOI]
13.  Yang L, Chan CC, Kwon OS, Liu S, McGhee J, Stimpson SA, Chen LZ, Harrington WW, Symonds WT, Rockey DC. Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in liver fibrosis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006;291:G902-911.  [PubMed]  [DOI]
14.  Yuan GJ, Zhang ML, Gong ZJ. Effects of PPARg agonist pioglitazone on rat hepatic fibrosis. World J Gastroenterol. 2004;10:1047-1051.  [PubMed]  [DOI]