基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2007-04-18; 15(11): 1225-1231
在线出版日期: 2007-04-18. doi: 10.11569/wcjd.v15.i11.1225
VEGF反义寡核苷酸对胆囊癌细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响
李海军, 庞作良, 毛拉艾沙·买买提
李海军, 庞作良, 毛拉艾沙·买买提, 新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科 新疆省乌鲁木齐市 830011
李海军, 2005年浙江大学医学院医学博士, 副教授, 副主任医师, 主要从事肝胆胰肿瘤的基础与临床研究.
通讯作者: 庞作良, 830011, 新疆乌鲁木齐市北京南路30号, 新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科. lhjun3408@163.com
电话: 0991-7819111 传真: 0991-7819096
收稿日期: 2006-12-26
修回日期: 2007-01-05
接受日期: 2007-01-27
在线出版日期: 2007-04-18

目的: 体外研究Oligofectamine介导的VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)转染对人胆囊癌GBC-SD细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响.

方法: 运用Oligofectamine介导的VEGF反义寡核苷酸(ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide, SODN)转染人胆囊癌细胞GBC-SD, 半定量RT-PCR检测转染后各组细胞不同时间的VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达变化, ELISA测定转染后各组细胞培养上清液VEGF蛋白浓度.

结果: 半定量RT-PCR发现ASODN组及ASODN+Oligofectamine组24, 48, 72, 96 h VEGF (ASODN组VEGF165: 0.686±0.033, 0.569±0.049, 0.489±0.036, 0.716±0.017; ASODN组VEGF121: 0.462±0.046, 0.338±0.034, 0.219±0.022, 0.471±0.038; ASODN+Oligofectamine组VEGF165: 0.601±0.021, 0.465±0.042, 0.416±0.023, 0.662±0.035; ASODN+Oligofectamine组VEGF121: 0.408±0.014, 0.286±0.019, 0.157±0.021, 0.418±0.037)、Flt-1 (ASODN组: 0.694±0.019, 0.562±0.045, 0.435±0.042, 0.724±0.026; ASODN+Oligofectamine组: 0.609±0.018, 0.442±0.049, 0.314±0.015, 0.614±0.029)及KDR (ASODN组: 0.667±0.063, 0.490±0.033, 0.301±0.029, 0.665±0.068; ASODN+Oligofectamine组: 0.523±0.048, 0.432±0.027, 0.218±0.036, 0.524±0.037) mRNA的表达显著低于Control组(P<0.05), 且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN强(P>0.05). ELISA测定结果显示ASODN组(281.26±18.62, 526.44±34.95, 791.13±20.99)及ASODN+Oligofectamine组(250.7±14.57, 506.09±19.14, 711.79±19.91) 24, 48, 72 h VEGF蛋白的分泌浓度均显著低于Control组(394.23±16.26, 711.6±26.21, 933.85±28.65)(P<0.05), 且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN强(P>0.05).

结论: Oligofectamine介导的VEGF ASODN能抑制GBC-SD细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌.

关键词: 胆囊癌细胞GBC-SD; 血管内皮生长因子; fms样酪氨酸激酶1; 含激酶插入区受体; 反义寡核苷酸; 半定量RT-PCR; 酶链免疫吸附试验
引文著录: 李海军, 庞作良, 毛拉艾沙·买买提. VEGF反义寡核苷酸对胆囊癌细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响. 世界华人消化杂志 2007; 15(11): 1225-1231
Effects of vascular endothelial growth factor antisense oligodeoxynucleotide on the mRNA expression of vascular endothelial growth factor, fms-like tyrosine kinase-1 and kinase insert domain-containing receptor and vascular endothelial growth factor protein excretion of gallbladder carcinoma GBC-SD cells in vitro
Hai-Jun Li, Zuo-Liang Pang, Mao-La-Ai-Sha Mai-Mai-Ti
Hai-Jun Li, Zuo-Liang Pang, Mao-La-Ai-Sha Mai-Mai-Ti, Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Correspondence to: Zuo-Liang Pang, Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China. lhjun3408@163.com
Received: December 26, 2006
Revised: January 5, 2007
Accepted: January 27, 2007
Published online: April 18, 2007

AIM: To investigate the effect of oligofectamine-mediated vascular endothelial growth factor (VEGF) antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) transfection on the mRNA expression of VEGF, fms-like tyrosine kinase-1 (Flt-1) and kinase insert domain-containing receptor (KDR) as well as VEGF protein excretion of gallbladder carcinoma GBC-SD cells in vitro.

METHODS: Gallbladder carcinoma GBC-SD cells were transfected with VEGF ASODN and scrambled oligodeoxynucleotide (SODN) by Oligofectamine mediation. The mRNA expression of VEGF, Flt-1 and KDR in GBC-SD cells of each group were detected by semi-quantitive reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and the excretion of VEGF protein was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

RESULTS: Semi-quantitive RT-PCR revealed that VEGF, Flt-1 and KDR mRNA expression in groups of ASODN (VEGF165: 0.686 ± 0.033, 0.569 ± 0.049, 0.489 ± 0.036, 0.716 ± 0.017; VEGF165: 0.462 ± 0.046, 0.338 ± 0.034, 0.219 ± 0.022, 0.471 ± 0.038; Flt-1: 0.694 ± 0.019, 0.562 ± 0.045, 0.435 ± 0.042, 0.724 ± 0.026; KDR: 0.667 ± 0.063, 0.490 ± 0.033, 0.301 ± 0.029, 0.665 ± 0.068) and ASODN + Oligofectamine (VEGF165: 0.601 ± 0.021, 0.465 ± 0.042, 0.416 ± 0.023, 0.662 ± 0.035; VEGF121: 0.408 ± 0.014, 0.286 ± 0.019, 0.157 ± 0.021, 0.418 ± 0.037; Flt-1: 0.609 ± 0.018, 0.442 ± 0.049, 0.314 ± 0.015, 0.614 ± 0.029; KDR: 0.523 ± 0.048, 0.432 ± 0.027, 0.218 ± 0.036, 0.524 ± 0.037) were significantly inhibited 24, 48, 72 and 96 h after transfection in comparison with those in the control group (P < 0.05), and the inhibitory effect of ASODN + Oligofectamine was stronger (P > 0.05). ELISA results discovered that VEGF protein excretion was markedly decreased in the culture media of ASODN (281.26 ± 18.62, 526.44 ± 34.95, 791.13 ± 20.99) and ASODN + Oligofectamine (250.7 ± 14.57, 506.09 ± 19.14, 711.79 ± 19.91) group (P < 0.05) as compared with that in the control group, and ASODN + Oligofectamine was more efficient (P > 0.05).

CONCLUSION: VEGF ASODN can inhibit VEGF, Flt-1 and KDR mRNA expression and VEGF protein excretion of GBC-SD cells, and the effect may be strengthened by Oligofectamine mediation.

Key Words: Gallbladder carcinoma cell line GBC-SD; Vascular endothelial growth factor; Fms-like tyrosine kinase-1; Kinase insert domain-containing receptor; Antisense oligodeoxynucleotide; Semi-quantitive reverse transcription-polymerase chain reaction; Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Citation: Li HJ, Pang ZL, Mai-Mai-Ti MLAS. Effects of vascular endothelial growth factor antisense oligodeoxynucleotide on the mRNA expression of vascular endothelial growth factor, fms-like tyrosine kinase-1 and kinase insert domain-containing receptor and vascular endothelial growth factor protein excretion of gallbladder carcinoma GBC-SD cells in vitro. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(11): 1225-1231
  • URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i11/1225.htm
  • DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i11.1225
0 引言

VEGF是高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂因子, 在肿瘤的生长和转移中起重要作用. 抑制VEGF及其受体信号转导通路的任何一个环节, 就可防止肿瘤的进展与转移. ASODN有专一序列的寡聚脱氧核苷酸, 能特异阻断靶基因的复制、转录和翻译, 可在基因水平抑制VEGF的分泌, 已成功地运用于神经胶质瘤[1-2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]和胃癌[5]等多种肿瘤[6-9]. 本实验体外运用Oligofectamine介导的VEGF ASODN转染人胆囊癌细胞GBC-SD, 通过RT-PCR和ELISA测定VEGF ASODN对GBC-SD细胞VEGF及其受体Flt-1和KDR在mRNA水平的表达, 并检测GBC-SD细胞VEGF蛋白分泌, 从分子水平考察VEGF ASODN抑制胆囊癌细胞GBC-SD生长、促进凋亡的基础.

1 材料和方法
1.1 材料

人胆囊癌细胞株GBC-SD(中科院上海细胞生物学研究所), RPMI1640培养基, 2.5 g/L胰蛋白酶(含EDTA)(Gibco公司), OligofectamineTM Reagent(20 μmol/L) (Invitrogen公司), VEGF反义寡核苷酸、VEGF错义寡核苷酸, VEGF, Flt-1, KDR与β-actin引物(上海生工生物工程公司).

1.2 方法

人胆囊癌GBC-SD细胞用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液(含青霉素和链霉素各100 mg/L), 37 ℃, 50 mL/L CO2培养箱培养. 待细胞长满瓶底70%-80%时采用2.5 g/L胰酶(含0.2 g/L EDTA)消化传代, 3-4 d传代1次, 传代后24-48 h处于指数生长期的细胞备实验用. 细胞经4 g/L台盼蓝染色, 拒染率>95%.

1.2.1 寡核苷酸合成: VEGF反义寡核苷酸及错义寡核苷酸序列参照文献[10], VEGF反义寡核苷酸(ASODN)序列为: 5'-TGGCTTGAAGATGTACTCGAT-3', VEGF错义寡核苷酸(SODN)序列为: 5'-TACGTAGTATGGTGTACGATC-3', 全硫代修饰, 保存于-70 ℃待用. OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染参照OligofectamineTM Reagent说明书和参照文献[11-14]进行.

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测: SODN和OligofectamineTM对GBC-SD细胞的毒性试验 实验设对照组, 2.5、5、10和20 μmol/L SODN组及0.5、1、2和4 μL Oligofectamine组. GBC-SD细胞37 ℃, 50 mL/L CO2度培养箱培养24 h后, 无血清RPMI1640换液, 并分别加入SODN(终浓度为2.5、5、10和20 μmol/L)和0.5、1、2和4 μL Oligofectamine. 12、24、48和72 h后, 用MTT法检测细胞活力, 并绘制各组细胞的生长曲线.

1.2.3 OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染: 指数生长期GBC-SD细胞, 以5×106/L细胞密度接种96孔板中. 混合5 μL Oligofectamine和10 μL 20 μmol/L SODN或10 μL 20 μmol/L ASODN, 制备成无血清转染液, 并加入细胞中, 培养4 h后, 吸弃转染液, 加入含小牛血清培养液继续培养, 此时设为0 h点.

1.2.4 RT-PCR法检测GBC-SD细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达的变化: 实验设对照组、SODN组、Oligofectamine+SODN组、ASODN组和Oligofectamine+ASODN组. OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染如前所述. 分别于转染后24, 48, 72和96 h提取总RNA, 逆转录后, PCR扩增各目的基因. 将扩增的RT-PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测, 用IS1000凝胶数字成像系统拍照, 采用Magnitec Ltd.公司Band Leader Applacation 3.0图像分析软件分析电泳条带灰度, 分析GBC-SD细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA变化. 引物相关参数见表1.

表1 引物序列及目的片段的长度.
名称方向引物序列目的片段的长度
VEGFforward:5'-CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG-3'403 bp (VEGF165)
reverse:5'-TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3'535 bp (VEGF121)
Flt-1forward:5'-CAAGTGGCCAGA GGCATGGAGTT-3'498 bp
reverse:5'-GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG-3'
KDRforward:5'-TATAGATGGTGTAACCCGGA-3'555 bp
reverse:5'-TTTGTCACTGAGACAGCTTGG-3'
β-actinforward:5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3'305 bp
reverse:5'-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3'

1.2.5 ELISA检测VEGF蛋白分泌的变化: 分别收集各组24, 48和72 h的培养液上清, 采用双抗夹心ELISA法检测其中的VEGF蛋白分泌, 具体方法按ELISA试剂盒说明书进行.

统计学处理 实验数据中计量资料以mean±SD表示, 多组资料的统计学检验采用方差分析, 各组均数间的相互比较采用Student-Newman-keuls法, 所有统计学检验均采用统计学软件SPSS11.0进行, P<0.05为有显著性差异.

2 结果
2.1 MTT法测定的SODN和OligofectamineTM对GBC-SD细胞的毒性试验

在12、24、48和72 h 4个作用时相点, 对照组、2.5、5、10和20 μmol/L SODN组及0.5、1、2和4 μL Oligofectamine组GBC-SD细胞生长无明显差异(P>0.05), 可见在试验浓度范围内, SODN和Oligofectamine对GBC-SD细胞均未见明显毒性. 各组细胞的生长曲线如图1所示.

图1
图1 不同浓度SODN和Oligofectamine对GBC-SD细胞的影响.
2.2 各组GBC-SD细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA水平的表达情况

RT-PCR扩增产物均经电泳, DNA分子标志标定, 确认为目的条带. 24, 48, 72和96 h GBC-SD细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA的表达水平在SODN组、SODN+Oligofectamine组和control组无明显差别(P>0.05), 而ASODN组及ASODN+Oligofectamine组则明显低于control组(P<0.05). ASODN组及ASODN+Oligofectamine组VEGF, Flt-1及KDR mRNA在同组不同时间作用点的表达水平也存在差异, 48和72 h组的抑制程度显著强于24 h组(P<0.05), 而96 h组与24 h组之间无显著差异(P>0.05), 可见VEGF ASODN及ASODN+Oligofectamine抑制VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达的作用在24-72 h左右逐渐增强, 在72 h抑制作用最强, 在72后抑制作用开始逐渐减弱, 且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN组更明显, 虽然两组在统计学上的差异并不显著(P>0.05)(图2-4).

图2
图2 各组不同时间VEGF165, VEGF121, Flt-1, KDR mRNA表达情况. A: VEGF165; B: VEGF121; C: Flt-1; D: KDR.
图3
图3 VEGF ASODN直接转染后不同时间VEGF165, VEGF121, Flt-1和KDR mRNA表达情况.
图4
图4 Oligofectamine介导的VEGF ASODN转染后不同时间VEGF165, VEGF121, Flt-1和KDR mRNA表达情况.
2.3 ELISA检测VEGF分泌的变化

ELISA检测结果显示, 24, 48和72 h GBC-SD细胞培养上清液中VEGF蛋白浓度在SODN组、SODN+Oligofectamine组和control组无明显差别(P>0.05), 而ASODN组及ASODN+Oligofectamine组则明显低于control组(P<0.05), 且ASODN+Oligofectamine组的VEGF蛋白浓度比ASODN组低, 虽然两组在统计学上的差异并不显著(P>0.05)(图5).

图5
图5 各组GBS-SD细胞培养液上清VEGF浓度.
3 讨论

VEGFR有3种属于酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases, RTKs)超家族, 命名为VEGFR-1 (F1t-1), VEGFR-2(KDR/F1k-1), VEGFR-3 (F1t-4). F1t-4分布在淋巴管内皮细胞, F1t-1和KDR/F1k-1则主要在血管内皮细胞内表达[14]. KDR/F1k-1激活后能使毛细血管通透性增高, 促进内皮细胞增生及迁移; 而F1t-1激活后可促进内皮细胞分化形成血管, 同时对F1t-1所引起的生物学效应起缓冲作用[15-16]. 正常情况下, 这些受体表达水平很低, 大多数组织中不能检测出, 但在病理情况下, 如各种肿瘤等, 常可在其附近血管内皮细胞中检测到受体高度表达. 以往的研究证明在许多人体肿瘤组织中存在VEGF及其受体的异常过度表达[17]. VEGF mRNA在肿瘤细胞内表达, 内皮细胞不表达VEGF, 但肿瘤内皮细胞过度表达Flt-l mRNA和KDR mRNA, 说明VEGF主要是旁分泌. 但通过对AIDS-Kaposi肉瘤的研究发现[18], VEGF受体的表达除血管内皮外还出现于肿瘤细胞, 用VEGF ASODN可特异地阻抑VEGF蛋白产生, 并可以剂量依赖的方式抑制肉瘤细胞生长. 这提示VEGF可能以自分泌、旁分泌两种方式刺激肿瘤细胞的生长. 不管是何种分泌方式, 在诱导肿瘤生长、转移过程中, VEGF表达的增高是始动因素. VEGF通过与其特异性受体(VEGFR)结合, 引起一系列的信号转导, 释放多种细胞因子与生长因子, 刺激血管内皮细胞增殖和迁移, 促进新生血管生成, 在肿瘤的生长和转移中起重要作用. 抑制VEGFR信号转导通路的任何一个环节, 就可防止肿瘤的进展与转移. 肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成, 而新生血管的形成受与酪氨酸激酶受体(RTKs)结合的特异性生长因子的调控. VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR)都是细胞表面的RTKs, 是信号转导通路的主要环节, 影响细胞的增生、分化、黏附、迁移和代谢. 许多研究提示Flt-1和KDR所引起的信号转导级联反应有所不同, KDR有明显促有丝分裂和化学趋化活性, 在血管通透性升高和血管生成过程中起主要作用, 而Flt-1在血管生成中的调节作用可能与调节内皮细胞间作用、内皮细胞与基底膜作用以及内皮细胞的迁移相关[10,19-21].

ASODN是能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合, 并阻止其转录和翻译的短核酸片段, 是目前迅速发展的新型的基因治疗药物[22-23]. 阳离子脂质体(cationic liposomes)能与带负电荷的核酸物质形成复合物, 可提高细胞对ASODN的摄人, 增加生物利用度, 同时可在一定程度上降低核酸酶对其的降解, 在基因治疗中具有独特的应用价值[24-31]. Oligofectamine是一种新型的专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体, 其效率高于市售的Lipofectamine.

半定量RT-PCR结果显示, VEGF ASODN及ASODN+Oligofectamine抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达的作用在24-72 h左右逐渐增强, 在72 h是抑制作用最强, 在72 h后抑制作用开始逐渐减弱, 且VEGF ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN更明显, 虽然两组在统计学上的差异并不显著(P>0.05), 而SODN组和SODN+Oligofectamine组则无抑制作用, 表明VEGF ASODN在mRNA水平能显著抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的VEGF及其受体Flt-1及KDR的表达. ELISA结果表明, VEGF ASODN及ASODN+Oligofectamine在蛋白水平抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的VEGF的表达, 且VEGF ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN更明显, 虽然两组在统计学上的差异并不显著(P>0.05). 可见VEGF ASODN能够特异性封闭VEGF基因并抑制VEGF及其受体Flt-1和KDR表达, 阻断其在促进肿瘤新生血管生成通路的信号转导, 从而能够抑制胆囊癌细胞GBC-SD生长增殖, 促进细胞凋亡, Oligofectamine作为一种专门用于寡核苷酸转染的阳离于脂质体, 能显著提高VEGF ASODN抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的增殖效应, 并且这种作用是序列特异性的, 而不是脂质体本身的作用或非序列特异性效应. 因此Oligofectamine可作为一种低毒载体应用于介导ASODN对胆囊癌的治疗.

从本实验的设计提示VEGF ASODN抑制胆囊癌细胞GBC-SD VEGF的表达, 以及其受体Flt-1和KDR表达, 即抑制自分泌的方式达到抑制胆囊癌细胞GBC-SD生长增殖, 促进细胞凋亡的效果. 也表明胆囊癌细胞GBC-SD存在VEGF自分泌的方式, 是否还具有旁分泌的方式, 即肿瘤内皮细胞过渡表达Flt-1和KDR mRNA, 需要进一步检测实体肿瘤内皮细胞mRNA及蛋白水平Flt-1和KDR表达情况. 总之, VEGF ASODN通过抑制VEGF的表达来抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的增殖效应. 本实验的结果为将来采用VEGF ASODN对胆囊癌进行基因治疗积累一定的理论基础和实验依据.

评论
背景资料

胆囊癌恶性程度高, 预后差, 目前外科手术疗效不尽人意, 近年来抗血管形成疗法作为一种崭新的抗癌策略已成为研究的焦点, ASODN是目前迅速发展的新型的基因治疗药物, 本文利用Oligofectamine介导的VEGFASODN转染人胆囊癌细胞, 探讨其对VEGF, Flt-1和KDR在mRNA和蛋白水平表达的影响, 为将来采用VEGFASODN对胆囊癌进行基因治疗积累理论基础和实验依据.

同行评价

本文研究了VEGF反义寡核苷酸对胆囊癌细胞VEGF, Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响, 文章具有一定的科学性、创新性和可读性, 能较好的反映我国肝胆病学临床和基础研究的先进水平.

编辑:张焕兰 电编:张敏

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