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世界华人消化杂志. 2006-02-18; 14(5): 497-501
在线出版日期: 2006-02-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i5.497
IL-24融合蛋白表达载体的构建及其对人小肠癌细胞的生长抑制作用
瞿少刚, 张秀萍, 陈群, 刘仿
瞿少刚, 陈群, 刘仿, 广东医学院微生物学及免疫学教研室 广东省湛江市　524023
张秀萍, 广东医学院实验中心 广东省湛江市　524023
瞿少刚, 男, 1971年出生, 湖北省广水市人, 汉族, 2005年武汉大学医学院硕士, 讲师, 主要从事微生物学和免疫学的教学与科研.
通讯作者: 瞿少刚, 524023, 广东省湛江市广东医学院微生物学及免疫学教研室. sgq9528@163.com
电话: 0759-2388583-6 传真: 0759-2284104
收稿日期: 2005-11-09
修回日期: 2005-11-15
接受日期: 2005-11-24
在线出版日期: 2006-02-18

目的: 构建人白细胞介素-24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达. 研究IL-24融合蛋白对人小肠癌细胞(HIC)的生长抑制作用.

方法: 用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增人IL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达. 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。提取并纯化IL-24融合蛋白，以不同浓度与HIC细胞共培养72 h，同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组、HIC细胞对照组及空白孔，采用MTT法检测各组人小肠癌细胞的体外增殖.

结果: 酶切结果证实, 成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致，融合蛋白为Mr 53 000，GST蛋白为Mr 29 000. IL-24融合蛋白以浓度依赖性的关系抑制HIC细胞的生长，并且在20和40 mg/L时的抑制率明显高于GST蛋白.

结论: 成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-IL-24, 并在E.coli BL21中表达. IL-24融合蛋白对HIC细胞生长有抑制作用.

关键词: IL -24; 原核表达; GST-IL-24融合蛋白; 小肠癌细胞系HIC
引文著录: 瞿少刚, 张秀萍, 陈群, 刘仿. IL-24融合蛋白表达载体的构建及其对人小肠癌细胞的生长抑制作用. 世界华人消化杂志 2006; 14(5): 497-501
Construction of IL-24 gene expression vector and inhibitory effect of IL-24 fusion protein on growth of human intestinal carcinoma cells
Shao-Gang Qu, Xiu-Ping Zhang, Qun Chen, Fang Liu
Shao-Gang Qu, Qun Chen, Fang Liu, Department of Microbiology and Immunology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, Guangdong Province, China
Xiu-Ping Zhang, Experiment center, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, Guangdong Province, China
Correspondence to: Shao-Gang Qu, Master, Department of Microbiology and Immunology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, Guangdong Province, China. sgq9528@163.com
Received: November 9, 2005
Revised: November 15, 2005
Accepted: November 24, 2005
Published online: February 18, 2006

AIM: To construct a recombinant expression vector of human interleukin-24 (IL-24) gene and express it in E. coli, and to investigate the inhibitory effect of IL-24-GST fusion protein on the growth of human intestinal carcinoma (HIC) cells.

METHODS: The human IL-24 cDNA fragment was amplified from plasmid TRAP-hIL-24 by polymerase chain reaction (PCR), then cloned into the prokaryotic vector pGEX-KG, and expressed inductively as a fusion protein in E. coli. The expressed GST-IL-24 fusion protein was purified via GST-Sepharose 4B Column and identified by SDS-PAGE and Western blot. In vitro cultured human HIC cells were treated with different concentrations of GST-IL-24 fusion protein and GST protein, and the proliferation of HIC cells was measured by MTT assay.

RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis showed that the recombinant prokaryotic expression vector pGEX-KG-IL-24 was constructed successfully and expressed stably in E. coli. The relative molecular mass (Mr) of the expression products was 53 000(GST-IL-24) and 29 000(GST), respectively, which was identical with the predictive value. GST-IL-24 fusion protein inhibited the proliferation of HIC cells in a concentration-dependent manner, and the inhibitory rates for 20 and 40 mg/L were obviously higher in fusion protein-treated cells than those in GST-treated cells.

CONCLUSION: The recombinant expression vector pGEX-KG-IL-24 is constructed successfully and expressed as a bioactive fusion protein in E. coli. GST-IL-24 fusion protein inhibits the growth of HIC cells in a concentration-dependent manner.

Key Words: Interleukin-24 (IL-24); Prokaryotic expression; GST-IL-24 fusion protein; Human intestinal carcinoma cells
0 引言

白细胞介素24(interleukin-24, IL-24)又称黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation-associated gene-7, MDA-7), 主要表达于脾、胸腺、外周血白细胞等免疫组织和分化的黑色素细胞, 其他组织细胞可被诱导表达. 人IL-24是用差减杂交的方法从IFN-b和mezerein诱导的人黑色素瘤细胞cDNA文库中筛选到的. 该基因在诱导分化的黑色素瘤细胞中呈高表达, 并能促进黑色素瘤细胞分化, 因此最初命名为MDA-7[1]. 由于MDA-7是一种小分子的糖蛋白, 因其结构的相似性、序列的同源性以及具有细胞因子样特征, 因而于2002年被命名为IL-24[2]. 人IL-24由7个外显子和6个内含子组成, 有1个编码206个氨基酸的完整开放读码框架, 表达的蛋白的Mr为23.8 kDa. 将IL-24/MDA-7基因克隆到复制缺陷型腺病毒中构建表达载体Ad-mda7, 转染至多种肿瘤细胞中, 可抑制肿瘤生长, 促进肿瘤细胞凋亡[3,4], 如可诱导黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌和非小细胞肺癌、宫颈癌、骨肉瘤、鼻咽癌、前列腺癌等[5-12]多种肿瘤细胞的凋亡, 抑制肿瘤的生长. 重组IL-24作为一种新型有希望的抗肿瘤药物, 已受到越来越多的重视[13]. 鉴于IL-24具有广阔的应用前景, 我们成功地构建了IL-24的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导其表达. 提取并纯化IL-24融合蛋白, 研究其对人小肠癌细胞 (HIC) 的生长抑制作用.

1 材料和方法
1.1 材料

含有人IL-24 cDNA的质粒TRAP-hIL-24[14], 由Dr. Zhong-Jia Tan和Dr. Peng Liang (Vanderbilt University)惠赠. 原核表达载体pGEX-KG、受体菌E. coli BL21(BlysS)及人小肠癌细胞系HIC均为本室保存. Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、蛋白分子质量标准, 均购自MBI公司. 异丙基硫代b-D半乳糖苷(IPTG)为Amresco公司产品. Gluthathion-Sepharose 4B亲和层析柱购自Pharmacia公司. 兔抗GST抗体由本室制备. HRP标记羊抗兔IgG购自Promega 公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成: 根据GeneBank人IL-24基因的序列(NM006850)设计引物, 上游引物为: 5'GCGGATCCAATTTTCAACAGAGGCTG-3', 含有BamHT酶切位点; 下游引物为: 5'CGCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3', 含有XhoⅠ酶切位点. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成.

1.2.2 目的基因的扩增与纯化: 以插入人IL-24完整编码区基因的质粒TRAPIL-24为模板, 采用上述引物从编码人IL-24N端第2个氨基酸的核苷酸开始进行PCR扩增, 并使人IL-24基因与GST基因处于同一阅读编码框架. 扩增反应的条件为; 9 ℃预变性2 min, 以9 ℃变性36 s, 57 ℃退火36 s, 7 ℃延伸1 min 24 s, 25个循环后, 再于7 ℃延伸5 min. PCR产物以12 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定. 将目的条带切下, 用DNA回收试剂盒回收纯化.

1.2.3 重组质粒pGEX-KG-IL-24的构建与鉴定: 将纯化的PCR产物和载体pGEX-KG用BamHTT和XhoⅠ双酶切后, 分别回收酶切产物, 在t4DNA连接酶作用下定向将IL-24基因片段与pGEX-KG连接, 以连接产物转化入DH5a感受态细菌, 在LB(Amp+)培养基中筛选培养. 挑取阳性克隆, 培养后小量提取质粒, 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性重组质粒并送交上海华诺生物技术有限公司测序.

1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定: 将鉴定成功的重组质粒DNA转化感受态细菌E.coli BL21, 在LB(Amp+)培养基中筛选培养. 挑取阳性克隆, 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定, 将含有重组表达质粒的E.coli BL21在LB(Amp+)培养液中, 于3 ℃振荡培养过夜. 以1%(v/v)接种于LB(Amp+)培养液中, 于3 ℃培养至A600nm约为 0.6时, 加入1 mmol/L IPTG, 于3 ℃继续诱导培养4 h. 离心收集菌体, 经超声碎菌后, 提取融合蛋白, 通过Gluthathion-Sepharose 4B亲和层析柱进行纯化. 将纯化融合蛋白进行SDS-PAGE(浓缩胶浓度为50 g/L, 分离胶浓度为120 g/L)分析后, 用考马斯亮蓝R250染色4 h, 用甲醇-冰醋酸脱色液脱色后观察结果.

1.2.5 Western blot分析: 将表达产物经SDS-PAGE后, 电转移至硝酸纤维素膜上, 用封闭液(含50 g/L脱脂奶粉的TBST)室温振荡封闭2 h. 依次滴加兔抗GST 抗体(室温反应1 h)及HRP标记羊抗兔IgG(反应同上), 用二氨基联苯氨(DAB)底物液显色后, 观察结果.

1.2.6 IL-24融合蛋白对HIC细胞体外增殖作用的测定: 人HIC细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养传代4次至对数生长期, 调整细胞浓度为1.5×105/L, 向96孔细胞培养板中每孔加入200 mL. 表达纯化的GST-IL-24融合蛋白过滤除菌后分别加入96孔细胞培养板中, 使终浓度分别为5.0, 10.0, 20.0, 40.0 mg/L, 同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组、HIC细胞对照组及空白孔, 各浓度梯度及对照组均设6个复孔. 置于3 ℃ 50 mL/L CO2条件下培养72 h后, 用MTT法测定A570 nm值, 计算不同浓度GST-IL-24融合蛋白及GST蛋白对HIC细胞生长的抑制率.

2 结果
2.1 重组原核表达载体 pGEX-KG-IL-24的鉴定

将重组质粒pGEX-KG-IL-24用BamHⅠ、XhoⅠ分别进行单酶切及双酶切, pGEX-KG的大小为5.0 kb, 扩增产物IL-24基因的大小为0.6 kb, 线状重组质粒pGEX-KG-IL-24的大小为5.6 kb, 说明重组质粒大小正确. pGEX-KG-IL-24经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切后, 分成5.0 kb和0.6 kb两个片段, 同预期值相符, 表明目的基因已正确插入pGEX-KG载体中(图1). 阳性重组质粒测序结果与GeneBank人IL-24基因的序列完全一致.

图1
图1 重组质粒pGEX-KG-IL-24的酶切鉴定. 1: pGEX-KG-IL-24 Xho I单酶切; 2: pGEX-KG-IL-24 BamH I单酶切; 3: pGEX-KG-IL-24 BamH I/Xho I双酶切; 4:IL-24 PCR 产物; 5: pGEX-KG BamH I单酶切;6: DNA marker.
2.2 GST-IL-24融合蛋白的表达与鉴定

以重组质粒转化感受态E.coli BL21, 挑取阳性克隆后进行酶切鉴定. 将经IPTG诱导表达的产物纯化后, 用SDS-PAGE分析. 结果表明, 在Mr为53.0 ku处有1条明亮带, 同预期的目的蛋白的Mr相符, Mr 29.0 ku处条带为融合蛋白GST-IL-24受细菌内蛋白酶的作用而降解产生的GST蛋白(图2). 将纯化的融合蛋白GST-IL-24经SDS-PAGE后, 电转移至硝酸纤维膜上, 用抗GST抗体检测显示, 在Mr为53.0 ku处有1条明显的带, Mr 29.0 ku处为GST蛋白(图3).

图2
图2 GST-IL-24融合蛋白的SDS-PAGE分析. 1: Protein Marker; 2: GST-IL-24融合蛋白; 3: GST蛋白.
图3
图3 GST-IL-24融合蛋白的Western blot分析. 1: GST-IL-24融合蛋白; 2: GST蛋白.
2.3 IL-24融合蛋白对HIC细胞体外增殖的作用

与GST蛋白组相比, 20.0 mg/L、40.0 mg/L GST-IL-24融合蛋白作用72 h后, HIC细胞的生长明显受到抑制, 抑制作用呈浓度依赖关系(图4).

图4
图4 GST-IL-24融合蛋白对HIC细胞生长的抑制作用．
3 讨论

肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病, 单一因素的介入往往不能达到理想的抑瘤效果. 因此寻找新的治疗方案及将多种治疗方法联合应用是肿瘤治疗研究的热点. 目前临床肿瘤治疗主要采用三大常规疗法, 但在实施过程中, 或由于切除的不彻底, 或由于严重的毒副作用不能够进一步加大剂量而使残存瘤细胞得以逃逸, 从而使肿瘤的治疗被复发所困扰. 因此如何消除残存肿瘤细胞是肿瘤治疗中防止复发的关键. IL-24/MDA-7促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的机制尚不清楚, 可能与以下的作用有关: (1)诱导和激活双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR), 使真核细胞翻译起始因子a亚单位磷酸化, 诱导肿瘤细胞凋亡[15]. (2)促进p38分裂素激活蛋白激酶的磷酸化, 使阻断生长和DNA损伤的基因家族过度表达, 而导致肿瘤细胞凋亡[4]. (3)使凋亡前蛋白(Bax, Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2, Bcl-XL)的比例增加, 加速肿瘤细胞的凋亡[3]. (4)IL-24通过下调肿瘤组织内促血管生成物质VEGF和TGF-b而抑制其血管生成[6,16]. 目前对肿瘤细胞抑制作用大多是通过病毒转染而获得的没有重组蛋白注射和共同孵育的资料. 有关IL-24对人小肠癌细胞(HIC)的作用国内外还未见报道. 本研究中, 为了探讨IL-24抗肿瘤机制, 我们将IL-24 cDNA插入至原核表达载体pGEX-KG中, 并在大肠杆菌中表达, 得到了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白, 为制备IL-24抗体、研究IL-24蛋白的功能及进一步用于临床治疗肿瘤奠定了基础. 体外研究显示, 加入GST-IL-24融合蛋白的HIC细胞生长速度明显低于加入GST蛋白的对照细胞.

利用基因工程技术生产的一些重组细胞因子如干扰素、EPO及IL-2等, 作为药物治疗肿瘤、造血障碍及感染等疾病已收到良好疗效, 成为新一代的药物. 细胞因子作为人体自身成分, 可调节机体的生理功能, 在很低剂量即可发挥作用, 因而疗效显著, 副作用相对较小. 本研究结果提示IL-24融合蛋白对肿瘤细胞的生长有较明显的抑制作用, 将来可作为一种辅助治疗方法, 与手术切除、放疗、化疗联合应用, 防止肿瘤复发．

评论
背景资料

白细胞介素24(interleukin-24, IL-24)具有许多独特的抗肿瘤作用, 比如特异性地诱导肿瘤细胞凋亡, 抑制肿瘤血管的形成, 能独立于p53, Rb基因抑制肿瘤细胞生长以及抗瘤谱广, 副作用小等. 将IL-24基因克隆到复制缺陷型腺病毒中, 转染至多种肿瘤细胞, 可抑制肿瘤生长, 促进肿瘤细胞凋亡, 但IL-24抗肿瘤的机制还没有完全研究清楚, 其在肿瘤细胞生理过程中的作用机制仍待阐明.

创新盘点

目前对肿瘤细胞抑制作用大多是通过病毒转染而获得的, 没有重组蛋白注射和共同孵育的资料. 有关IL-24对人小肠癌细胞(HIC)的作用国内外还未见报道. 本研究将IL-24 cDNA插入至原核表达载体pGEX-KG中, 并在大肠杆菌中表达, 得到了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白, 为进一步分析利用纯化重组蛋白研究IL-24抗肿瘤活性的机制及进一步用于临床治疗肿瘤奠定了基础.

应用要点

IL-24能抑制多种肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡, IL-24 相关生物疗法将具有广阔的应用前景.

名词解释

差减杂交(subtr-active hybridiza-tion): 实验样品的cDNA称为te-ster(含有目的基因), 对照样品的cDNA称为driver, 微量的tester和过量的driver在合适的条件下杂交, te-ster中和driver中相同的基因杂交子就被除去, 在te-ster中独特的基因被富集, 通过PCR方法扩增出来, 得到差减库, 扩增产物可以通过T载体直接克隆和测序分析. 然后探讨两个相关组织或两个关联过程中基因表达差异的情况, 筛选基因组特异片段. 通过该方法可以获得某些基因在某一样品中表达, 而在对应的样品中不表达或表达量很低.

电编:韩江燕 编辑:张海宁

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