选择性环氧化酶-2抑制剂对肝癌细胞侵袭力的影响

摘要

目的: 研究选择性环氧化酶-2抑制剂尼美舒利(Nimesuli, Nim)对肝癌细胞SMMC-7721增殖和侵袭力的影响并探讨其作用机制.

方法: 应用Nim作用于SMMC-7721细胞, 并设对照组和实验组(Nim 25, 50, 100, 200, 400 mmol/L), MTT法检测Nim作用24、48、72 h后, 对SMMC-7721细胞增殖的影响; 用Transwell小室检测Nim作用24 h后对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响, 并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、明胶酶谱法分析Nim对SMMC-7721细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP) mRNA和酶活性的影响.

结果: Nim对SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用, 且呈剂量和时间依赖性; Nim 25, 50, 100, 200, 400 mmol/L作用后, 与对照组比较Nim能降低SMMC-7721细胞分泌的MMP mRNA和酶的活性(MMP-2 mRNA: 0.968, 0.545, 0.330, 0.158, 0.083 vs 1.063, P<0.05 或P<0.01; MMP-9 mRNA: 1.005, 0.758, 0.465, 0.208, 0.103 vs 1.075, 除25 mmol/L作用外, 其余P<0.01); Nim作用后SMMC-7721细胞穿透聚碳酸酯膜的能力显著降低(SMMC-7721细胞穿透聚碳酸酯膜抑制率为7.8%, 28.0%, 35.6%, 53.6%, 61.4%), 与对照组比较有显著差异(P<0.05).

结论: 选择性环氧化酶-2抑制剂Nim可以抑制肝癌细胞的生长和其侵袭力, Nim抑制肝癌细胞侵袭力的作用机制与通过降低MMP水平有关.

关键词: 肝肿瘤; 前列腺素内源性过氧化物合酶; 基质金属蛋白酶

Effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitor on invasion of human hepatocelluar carcinoma cells

Zheng-Dong Fang, Jian-Sheng Li, Xiu-Cai Xu

Zheng-Dong Fang, Jian-Sheng Li, Department of General Surgery, the Affiliated Anhui Provincial Hosptial of Auhui Medical University, Hefei 230001, Anhui Province, China

Xiu-Cai Xu, Department of Central Laboratory, the Affiliated Anhui Provincial Hosptial of Auhui Medical University, Hefei 230001, Anhui Province, China

Correspondence to: Zheng-Dong Fang, Department of General Surgery, the Affiliated Anhui Provincical Hosptial of Auhui Medical University, 9 Lujiang Road, Hefei 230001, Anhui Province, China. fangzhengdong@126.com

Received: December 8, 2005
Revised: December 21, 2005
Accepted: December 31, 2005
Published online: January 28, 2006

Abstract

AIM: To investigate the effects of Nimesuli, a selective cyclooxygenase inhibitor, on the invasion of human hepatocelluar carcinoma cell line SMMC-7721 and its mechanism.

METHODS: Human hepatocelluar carcinoma cell line SMMC-7721 was divided into control (C) and Nimesuli (N) group. The cells in group N were treated with Nimesuli (25, 50, 100, 200, 400 μmol/L) and those in group C were treated with dimethylsulfoxide (DMSO). MTT reduction assay was used to evaluate the inhibitory rate, and Transwell chamber assay was performed to determine the effect of Nimesuli on the invasion of SMMC-7721 cells. The expression of matrix metalloproteinase (MMP) mRNA and enzymatic activity of SMMC-7721 cells were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and gelatin zymography, respectively.

RESULTS: Nimesuli inhibited the proliferation of SMMC-7721 cells in a time- and concentration-dependent manner. In comparison with those in the group C, the expression of MMP mRNA and enzymatic activity in group N were obviously lower after 25, 50, 100, 200, and 400 μmol/L Nimesuli treatment (MMP2 mRNA: 0.968, 0.545, 0.330, 0.158, 0.083 vs 1.063, P <0.05 or P <0.01; MMP-9 mRNA: 1.005, 0.758, 0.465, 0.208, 0.103 vs 1.075, P <0.01 except the result of 25 μmol/L Nimesuli treatment). The invasion of SMMC-7721 cells was significantly inhibited in group N (P <0.05), and the inhibitory rates of the cells' penetrating polycarbonates were 7.8%, 28.0%, 35.6%, 53.6%, 61.4% for 25, 50, 100, 200, and 400 μmol/L, respectively.

CONCLUSION: The selective cyclooxygenase inhibitor, Nimesuli, can inhibit the growth and invasion of SMMC-7721 cells and the possible mechanism may be involved in the down-regulation of MMP level.

Key Words: Hepatocelluar carcinoma; Prostaglandin-endoperoxide synthase; Matrix metalloproteinase

0 引言

近年来研究发现[1,2], 环氧化酶-2(cycloxygenase-2, COX-2)与多种恶性肿瘤的生成、生长有密切关系. 流行病学、体内外实验研究表明[3,4], 非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAID)对消化道肿瘤有防治作用, 选择性COX-2抑制剂可以抑制肿瘤的生长. 随着COX-2与肿瘤关系的研究进展, COX-2与肝癌的关系作用也逐渐受到人们关注, 近年来有研究表明, COX-2的表达与肝癌的临床病理分期和预后有关[5], Huang et al[6]研究认为, COX-2抑制剂可以通过诱导细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖来抑制肝癌细胞的生长, 但COX-2抑制剂对肝癌侵袭的影响研究不多. 我们研究了选择性环氧化酶抑制剂尼美舒利(Nimesuli, Nim)对肝癌细胞SMMC-7721生长及侵袭力的影响, 并探讨Nim对肝癌细胞SMMC-7721分泌的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase, MMP)活性的影响, 分析选择性环氧化酶-2抑制剂对肝癌细胞侵袭力的影响及可能的作用机制, 为肝癌转移的预防和治疗开辟新的途径.

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌细胞SMMC-7721购自中国科学院上海细胞生物研究所, 尼美舒利、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶为Sigma公司产品, 新生牛血清为杭州四季青公司产品, 明胶为Amersco公司产品, Trizol总RNA提纯试剂盒、RPMI 1640培养基为Gibco公司产品, MMLV逆转录酶为Promega公司产品, MMP-2、MMP-9、β-actin引物由上海生工公司合成, 人工基质Martrigel为BD公司产品, Transwell小室为Costar公司产品.

1.2 方法

人肝癌细胞SMMC-7721用含100 mL/L新生牛血清+100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基, 置37℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养, 细胞换液时间为1-2 d, 传代3-5 d, 传代前用2.5 g/L胰酶消化. 实验分组: 对照组(只含100 mg/L DMSO), 实验组(每组加入终浓度分别为25、50、100、200、400 mmol/L的Nim).

1.2.1 MTT检测Nim对SMMC-7721细胞生长的影响: 取对数生长期SMMC-7721细胞, 调整细胞浓度为1×10⁹/L, 接种于96孔培养板, 每孔加液量200 mL. 24 h后换液, 按上述试验分组, 并设空白调零孔, 每组设4个复孔, 37℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养24、48、72 h后, 每孔加入5 g/L MTT 20 mL, 继续培养4 h, 吸去孔内培养液, 分别加DMSO溶液150 mL, 振荡溶解10 min, 酶标仪测490 nm波长每孔吸光度(空白孔调零), 记录各孔吸光度(A). 计算细胞生长抑制率, 抑制率=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%.

1.2.2 细胞侵袭重建基底膜实验: SMMC-7721细胞体外侵袭能力的测定在Transwell小室中进行, 具体试验方法参照文献[7]: 于4℃融解Matrigel,每孔50 mL加入预冷的Transwell侵袭小室各孔的上室中, 将培养板置于37℃孵育1ｈ, 少量PBS清洗各孔. 根据上述实验分组, 用无血清培养液和含不同浓度Nim的无血清培养液制备SMMC-7721细胞悬液,使细胞密度为1×10⁹/L,分别加入各孔上室中,每孔200 mL, 在下室分别加入预先制备的SMMC-7721细胞培养上清液600 mL作为趋化因子, 每个孔重复3次. 37℃、50 mL/L CO₂孵育24ｈ. 弃去上室液体, 取出聚碳酸酯膜, 擦净膜上的基底膜胶及未穿过的细胞, 经40 g/L多聚甲醛固定30 min、常规HE染色, 随机于200倍光镜下取上、下、左、右、中心5个视野, 计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数, 取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力, 并计算抑制率. 重复试验3次. 抑制率=(对照组侵袭细胞数-实验组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%.

1.2.3 Nim对SMMC-7721细胞MMP: 取对数生长期SMMC-7721细胞1×10⁶接种于培养瓶中, 按上述实验分组, 药物作用24 h后常规收集细胞, 各组均重复3瓶. 选用β-actin为内参照, MMP-2, MMP-9, β-actin引物序列(表1). 按Trizol试剂盒说明一步法提取总RNA, 紫外分光光度仪测RNA纯度并定量. 取总RNA进行逆转录, 反应体系20 mL: 含Oligo(dT)₁₅ 1 mL, MMLV逆转录酶1 mL, RNA 1.0 mg, 10 mmol/L dNTPs 2 mL, RNasin 1 mL, 42℃温浴60 min, 将反应混合物加热至70℃、10 min以终止反应. PCR反应体系40 mL: cDNA 4 mL,10 mmol/L dNTPs 2 mL,10×buffer(含Mgcl₂) 0.8 mL,上、下游引物各1 mL, TaqDNA合成酶0.5 mL. PCR扩增的循环条件为: 96℃ 3 min后, 94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 60 s, 35个循环, 72℃延伸10 min, 同时对内对照β-actin进行扩增. 在20 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳, 经UV-300紫外分析仪OHM026(珠海黑马)及其软件分别计算MMP-2、MMP-9与β-actin吸光度的比值表示MMP-2, MMP-9 mRNA的相对含量.

表1 扩增片段使用的引物序列和长度.

名 称	引物	扩增片段长度
MMP-2	正义链5'- CCACGTGACAAGCCCATGGGGCCCC-3'	480 bp
	反义链5'-GCAGCCTAGCCAGTCGGATTTGATG-3'
MMP-9	正义链 5'-GCCACTTGTCGGCGATAAGG-3'	243 bp
	反义链 5'-CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3'
β-actin	正义链5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'	610 bp
	反义链5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACAATGGAGGG-3'

1.2.4 采用明胶酶谱法测定细胞上清液中的MMP的活性: 明胶酶谱实验方法参照文献[8]: 取对数生长期SMMC-7721细胞, 调整细胞密度为1×10⁹/L, 接种于24孔培养板, 换用无血清培养液培养, 按上述实验分组加入药物, 继续培养24ｈ后收集培养液并活细胞计数. 所收集的培养液经1 200 r/min, 4℃离心10 min 0.22 mm滤膜过滤, 以细胞数为依据调整体积, 分装后立刻进行酶谱分析. 将细胞条件培养液上样(按10⁶个细胞量折算培养上清的电泳上样量)与等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液混合, 上样于80 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶(含1 g/L明胶), 4℃电泳,电压为12 V/cm,直至溴酚蓝跑至凝胶底部. 以复性缓冲液(25 g/L Triton-X 100)于室温下洗胶2次, 每次30 min. 凝胶置于孵育缓冲液(含50 mmol/L Tris HCl, 1 mmmol/L ZnCL₂, 0.5 g/L叠氮钠, pH7.6)中, 37℃恒温摇床缓慢摇动18ｈ. 以染色液(10g/L的考马斯亮蓝R250、100 mL/L乙酸、100 g/L异丙醇)染色30 min, 以脱色液(100 mL/L乙酸、100 g/L异丙醇)脱色至合适. 胶原酶呈现为蓝色背景下的透明条带 ,分别位于M_r 72 000和92 000位置处. 应用凝胶成像分析系统测定各条带的平均吸光度 (A值)及其面积, 以电泳条带的积分吸光度值代表酶活性进行定量分析, 计算各条带的积分V值 (V值 =平均A值×面积 )

统计学处理 数据采用平均数±标准差(mean±SD)表示, 利用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析, P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 Nim对SMMC-7721细胞生长的影响

25 mmol/L Nim作用24 h后, 细胞生长抑制率为5.6 %(P>0.05), 对SMMC-7721细胞生长抑制作用无差异, 但其余各组与对照组相比Nim对SMMC-7721细胞生长抑制作用均有显著性意义(P<0.01, 图1). 随着时间和剂量增加, 药物对肝癌细胞的抑制率逐渐上升, 呈时间、剂量依赖性. 在24 h, 25、400 mmol/L Nim的细胞生长抑制率分别为5.6%、26.5%, 而在72 h, 同等药物浓度的抑制率分别为15.2%、79.9%, 为减少因药物抑制细胞生长造成的侵袭能力降低因素影响, 故在侵袭实验中选用药物作用24 h.

图1 Nim对SMMC-7721细胞生长的抑制作用.

2.2 Nim对SMMC-7721体外侵袭能力的影响

各种不同药物浓度作用24 h后, 检测SMMC-7721细胞穿透基底膜成分Matrigel发现, 25 mmol/L Nim作用后, 与对照组相比其抑制率为7.8%(P<0.05), 抑制SMMC-7721细胞穿膜的能力有统计学意义, 而其余各组对SMMC-7721细胞穿膜能力的抑制作用均有显著统计学意义(P<0.01), 最高抑制率达61.3%(表2). 结果表明, Nim对SMMC-7721体外侵袭能力有明显的抑制作用, 且呈剂量依赖性.

表2 Nim对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响.

组别		下室细胞数	抑制率 (%)
对照组		58.60±6.95
实验组	25 μmol/L	54.00±3.28	7.8a
	50 μmol/L	42.2±3.96	28.0b
	100 μmol/L	35.4±3.91	35.6b
	200 μmol/L	27.2±1.92	53.6b
	400 μmol/L	22.6±2.70	61.4b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

2.3 Nim对SMMC-7721细胞MMP mRNA的影响

在SMMC-7721细胞中可以检测到MMP mRNA的表达. 各种不同药物浓度作用24 h后, MMP-2, MMP-9表达均有下降(图2, 表3), 与对照组比较下降程度有显著差异.

图2 SMMC-7721细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达的RT-PCR结果.

表3 SMMC-7721细胞MMP-2, MMP-9 mRNA的定量分析 (mean±SD).

Nim	MMP-2m RNA	MMP-9m RNA
0(对照)	1.063±0.062	1.075±0.039
25 μmol/L	0.968±0.033a	1.005±0.021
50 μmol/L	0.545±0.062b	0.758±0.059b
100 μmol/L	0.330±0.032b	0.465±0.037b
200 μmol/L	0.158±0.025b	0.208±0.036b
400 μmol/L	0.083±0.017b	0.103±0.015b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

2.4 Nim对SMMC-7721细胞MMP酶活性的影响

SMMC-7721分泌的上清夜中能够检测到MMP-2, MMP-9的表达, 通过积分V值可以看出MMP-2的活性明显高于MMP-9. 不同浓度Nim作用于SMMC-7721细胞24 h后, MMP-2, MMP-9表达均下降, 与对照组比较, 实验组V值下降具有显著性差异(图3, 4). 其抑制作用随药物浓度的增大而增强, 呈剂量依赖性.

图3 SMMC-7721细胞分泌的MMP-2, MMP-9的酶谱分析. 1-5: 400, 200, 100, 50, 25 μmol/LNim; C: 对照组.

图4 SMMC-7721细胞分泌的MMP-2, MMP-9各条带积分V值比较.

3 讨论

环氧化酶(cycloxygenase, COX)是催化花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins, PGs)的关键酶, 目前认为, COX有COX-1和COX-2两种同功异构体[9]. COX-1是一种组成型酶, 在许多组织中表达, 并参与细胞正常的生理功能; 而COX-2为一种诱导型酶, 静息时不表达, 只有在细胞因子、肿瘤剂及癌基因等促分裂剂刺激下才产生. 越来越多的研究提示, COX-2的表达与肿瘤的发生和发展密切相关[10]. 近来发现, COX-2能诱导肿瘤产生侵袭与转移, 在胃、结肠癌的研究中表明[11,12], COX-2的表达与淋巴结受侵呈正相关, 然而, COX-2引起肿瘤侵袭、转移的机制仍不明确.

肿瘤侵袭、转移是恶性肿瘤的重要生物学行为, 肿瘤细胞在侵袭转移过程中必须破坏由细胞间基质和基底膜组成的细胞外基质. 肿瘤细胞通过自身或诱导宿主细胞产生多种基质蛋白溶解酶, 如基质金属蛋白酶、纤溶酶原激活物、胱氨酸蛋白酶等, 使细胞间基质的主要成分被降解, 形成局部缺损区, 然后肿瘤细胞穿过细胞间基质及基底膜, 进入血循环进一步形成转移灶. 在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶是主要的直接作用者. MMP是一组锌离子依赖性内肽酶, 根据底物的不同, 可分为不同的种类, 其中明胶酶类(包括MMP-2和MMP-9)的作用底物是Ⅳ/Ⅴ型胶原. 大量研究表明, 明胶酶与肿瘤侵袭转移的关系甚为密切[13],因为明胶酶不但可以酶解细胞间基质成分还能酶解基底膜主要成分- Ⅳ型胶原[14]. McKenna et al[15]的实验表明,高转移性肝癌组织MMP的表达及活性升高,与肝癌的高转移、高复发性有直接的关系. 最近的实验表明, COX-2的高表达可以引起MMP-2和MMP-9的活性的增强. 因此, 我们探讨了COX-2抑制剂能否通过明胶酶来降低肝癌的侵袭和转移. 我们通过MTT法检测显示: Nim可以使SMMC-7721细胞生长受到抑制, 与对照组比较差异有显著性, 说明Nim能抑制SMMC-7721细胞生长. Transwell小室是目前测定肿瘤细胞体外侵袭能力比较理想的实验模型, 本研究提示: Nim可以显著降低SMMC-7721细胞的侵袭能力, 且随药物作用浓度的增加, 其抑制作用逐渐增强, 在一定范围内呈剂量依赖性. RT-PCR及明胶酶谱检测显示, 在SMMC-7721细胞中能够检测到MMP-2, MMP-9的表达, Nim能够抑制SMMC-7721细胞分泌MMP-2, MMP-2的表达及降低其活性, 从而说明Nim可以通过影响肝癌细胞MMP来降低其侵袭能力.

总之, 本实验初步证实了选择性COX-2抑制剂可以通过MMP途径, 降低肝癌细胞的侵袭能力, 从而抑制肝癌的转移和复发. 这为选择性COX-2抑制剂防治肝癌提供了一定的理论依据, 其有可能成为肝癌的防治手段之一.

评论

背景资料

近年来研究表明, COX-2参与了肿瘤的发生发展, 在许多肿瘤中过度表达, 其中包括胃肠道肿瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等, 而其抑制剂则具有防治肿瘤的作用.

研发前沿

许多研究提示COX-2与肝癌的发生、发展有很大关系, 在肝癌的基础研究中发现COX-2抑制剂可以通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来抑制肝癌生长.

创新盘点

本文主要是通过细胞侵袭重建基底膜实验, 探讨COX-2抑制剂对肝癌细胞侵袭力的影响；并检测COX-2抑制剂对肝癌细胞分泌的MMP有无影响, 探讨COX-2抑制剂产生这种作用的机制.

应用要点

本实验初步证实了COX-2抑制剂可以降低肝癌细胞的侵袭能力, 从而抑制肝癌的转移和复发, 这为COX-2抑制剂防治肝癌提供了一定的理论依据, 其有可能成为肝癌的防治手段之一.

同行评价

本文对选择性环氧化酶-2抑制剂Nimesuli对肝癌细胞SMMC-7721侵袭力的影响进行了探讨, 立题新颖, 实验设计较系统规范, 文笔较流畅, 具有一定的指导意义, 但要支持Nimesuli具有抗侵袭作用还需更多的实验数据.

备注

编辑:潘伯荣 审读: 张海宁 电编: 张勇

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