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世界华人消化杂志. 2006-09-28; 14(27): 2679-2683
在线出版日期: 2006-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v14.i27.2679
亚细胞毒性剂量As2O3增加胃癌细胞对rhTRAIL的敏感性及其机制
仲飞, 朱兆华, 张世能
仲飞, 朱兆华, 张世能, 中山大学附属第二医院消化科 广东省广州市 510120
仲飞, 中山大学2004级在读博士, 主要从事消化系统肿瘤的基础与临床研究.
通讯作者: 朱兆华, 510120, 广东省广州市沿江西路107号, 中山大学附属第二医院消化科. zhuzhaohua@163.com
电话: 020-81332490
收稿日期: 2006-06-28
修回日期: 2006-07-08
接受日期: 2006-08-10
在线出版日期: 2006-09-28

目的: 研究亚细胞毒性剂量As2O3对rhTRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响及其机制.

方法: 人胃腺癌细胞株SGC7901以As2O3(1 μmol/L), rhTRAIL(500 μg/L)及两者联用处理; 采用AnnexinV-FITC和PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡; 用间接免疫荧光染色结合流式细胞技术检测细胞表面TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5分子表达; RT-PCR方法检测TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5 mRNA表达.

结果: rhTRAIL在单用或与As2O3联用时均可以诱导胃癌SGC7901细胞凋亡, 并且随着作用时间延长(12-72 h), 细胞凋亡率逐渐增高. As2O3与rhTRAIL联用24, 48, 72 h后, SGC7901细胞凋亡率分别显著高于单用rhTRAIL处理相同时间细胞(36.49%±7.12%, 47.13%±3.44%, 55.63%±7.16% vs 29.78%±3.18%, 38.56%±1.89%, 43.12%±6.23%, P<0.05); As2O3单用或联用rhTRAIL处理SGC7901细胞24 h后, 细胞表面TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5分子的平均荧光密度(MFI)较对照组细胞显著增加(R1/DR4: 29.44±4.29, 26.14±3.40 vs 13.45±3.81, P<0.05或P<0.01; R2/DR5: 28.04±0.79, 31.47±4.56 vs 16.45±5.07, P<0.05或P<0.01); 与此同时, TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5 mRNA表达水平增高.

结论: 亚细胞毒性剂量As2O3可能通过增加TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5基因表达、上调细胞表面TRAIL死亡受体从而增加胃癌细胞SGC7901对rhTRAIL的敏感性, 两药可能联合用于治疗胃癌.

关键词: 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体; 三氧化二砷; 胃癌; 凋亡
引文著录: 仲飞, 朱兆华, 张世能. 亚细胞毒性剂量As2O3增加胃癌细胞对rhTRAIL的敏感性及其机制. 世界华人消化杂志 2006; 14(27): 2679-2683
Subcytotoxic concentration of arsenic trioxide enhances the sensitivity of SGC7901 cells to rhTRAIL and its mechanism
Fei Zhong, Zhao-Hua Zhu, Shi-Neng Zhang
Fei Zhong, Zhao-Hua Zhu, Shi-Neng Zhang, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Correspondence to: Zhao-Hua Zhu, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China. zhuzhaohua@163.com
Received: June 28, 2006
Revised: July 8, 2006
Accepted: August 10, 2006
Published online: September 28, 2006

AIM: To investigate the effects of subcytotoxic concentration of arsenic trioxide (As2O3) on the rhTRAIL-induced apoptosis in SGC7901 cells and its related mechanism.

METHODS: The human gastric cancer cell line SGC7901 was treated with As2O3 (1 μmol/L), rhTRAIL (500 μg/L), respectively, or in combination. The cell apoptosis was detected by flow cytometry (AnnexinV-FITC-PI assay); the expression of TRAIL R1/DR4 and TRAIL R2/DR5 on the cell surface were determined by indirect fluorescence staining and flow cytometry; the expression of TRAIL R1/DR4 and TRAIL R2/DR5 mRNA was determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).

RESULTS: Used along or in combination with As2O3, rhTRAIL induced apoptosis of SGC7901 cells in a time-dependent manner (12-72 h). After being exposed to rhTRAIL in combination with As2O3 for 24, 48 and 72 h, the apoptosis rates of SGC7901 cells were significantly higher than those of cells treated with the same concentration of rhTRAIL alone (36.49% ± 7.12%, 47.13% ± 3.44%, 55.63% ± 7.16% vs 29.78% ± 3.18%, 38.56% ± 1.89%, 43.12% ± 6.23%, respectively, P < 0.05). As2O3, used along or in combination with rhTRAIL (500 μg/L) for 24 h, increased the expression of TRAIL R1/DR4 and TRAIL R2/DR5 on the cell surface significantly (R1/DR4: 29.44 ± 4.29, 26.14 ± 3.40 vs 13.45 ± 3.81, P < 0.05; R2/DR5: 28.04 ± 0.79, 31.47 ± 4.56 vs 16.45 ± 5.07, P < 0.05), and at the same time, increased the mRNA levels of the two receptors.

CONCLUSION: Subcytotoxic concentration of As2O3 can sensitize SGC7901 cells to rhTRAIL through up-regulation of TRAIL R1/DR4 and TRAIL R2/DR5 on cell surface and their mRNA levels. Combination of rhTRAIL and As2O3 can be used in the therapy of gastric cancer.

Key Words: Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; Arsenic trioxide; Gastric carcinoma; Apoptosis
0 引言

胃癌是常规化疗效果较差的恶性肿瘤, 探索新的药物治疗方案非常重要. 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是近年发现的肿瘤坏死因子家族新成员, 对包括胃癌细胞在内的多种肿瘤细胞有一定的凋亡诱导效应, 而对大多数正常细胞无影响, 有希望用于肿瘤治疗. 本实验研究了亚细胞毒性剂量As2O3对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响及其机制, 旨在探索低毒高效的胃癌治疗新方案.

1 材料和方法
1.1 材料

SGC7901人胃腺癌细胞系购自中山大学医学院动物实验中心细胞库, 在37℃、饱和湿度下于5 mL/L CO2培养箱中培养, 培养基为含100 mL/L胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640(Gibco BRL公司)培养液, 待其贴壁生长至70%-80%融合时, 用2.5 g/L胰酶(Amresco公司)消化传代培养. 人重组可溶性TRAIL蛋白(rhTRAIL)购自R&D公司(375-TL); As2O3注射液购自Sigma公司; 兔抗人TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5单克隆抗体分别购自Santa Cruz公司(sc-7863)和Imgenex公司(IMG-120A); FITC标记的羊抗兔IgG均为Chemicon公司产品(AP132F); AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Bocheringer Mannheim公司); 流式细胞仪(美国BD公司); PCR引物由上海生工合成; RNA提取试剂盒TRIzol和AMV反转录酶试剂盒购自Invotrgen公司; 酶标仪(Bio RAD550型).

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪检测细胞凋亡: 实验设对照组(未加任何处理因素); As2O3(1 μmol/L, 预试验确定)组、rhTRAIL(500 μg/L)组与同浓度rhTRAIL加1 μmol/L As2O3的联合用药组, 细胞在加药12, 24, 48及72 h后, 每份收集1×106个细胞. 含20 g/L牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤2次, 分别加入FITC标记的AnnexinV和PI(操作按说明书进行), 避光放置1 h, 流式细胞仪检测, 每次读取10 000个细胞, Cell Quest软件进行数据分析. AnnexinV阳性的细胞认为是凋亡细胞, 而PI阳性且AnnexinV阴性的细胞认为是坏死细胞, 计算细胞凋亡率. 凋亡率(%) = (AnnexinV+PI+细胞数+ AnnexinV+PI-细胞数)/10 000×100%.

1.2.2 流式细胞仪检测细胞表面TRAIL死亡受体: 取对照组、As2O3组、rhTRAIL组与联合用药组(分组同上)在药物作用12, 24, 48, 72 h后, 每组取1×106细胞, 以兔抗人抗DR4或DR5的mAb为一抗, 以FITC标记羊抗兔IgG为二抗, 进行间接免疫荧光染色. 同样方法以非特异性兔IgG为一抗制备标本, 做为阴性对照. 用流式细胞仪分析DR4和DR5分子的表达, 结果用平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)表示.

1.2.3 RT-PCR检测TRAIL死亡受体的基因表达: 取对照组、As2O3组和联合用药组, 在加药24 h后收集细胞. 用RNA提取试剂盒TRIzol提取总RNA, 用AMV反转录酶试剂盒合成cDNA. PCR扩增所用引物根据GenBank数据库中DR4和DR5的cDNA序列设计. DR4基因的上游引物为5'-agcatgtcagtgcaaaccag,下游引物为5'-tcctcctctgagacccttca, 扩增产物为490 bp; DR5基因的上游引物为5'-gagctaagtccctgcaccac,下游引物为5'-tcctggacttccatttcctg, 扩增产物为420 bp. β-actin为内参照物,扩增产物为200 bp. PCR反应条件为94℃ 1 min, 57℃ 30 s, 72℃ 1 min, 循环30次. 产物在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳, 所产生的条带经扫描成像后进行分析.

统计学处理 所有实验至少重复3次, 结果以mean±SD表示. 采用t检验进行统计学分析.

2 结果
2.1 SGC7901细胞凋亡

各处理组细胞不同时间凋亡率见表1. 1 μmol/L As2O3不能明显诱导SGC7901细胞凋亡; 而单用500 μg/L rhTRAIL以及上述浓度rhTRAIL联合1 μmol/L As2O3时可以明显诱导SGC7901细胞凋亡, 与对照组有显著统计学差异; 而且, 单用rhTRAIL或其与As2O3联用时, SGC7901细胞凋亡率随作用时间延长逐渐增高; 另外, 1 μmol/L As2O3虽然不能诱导SGC7901细胞凋亡, 但在作用24 h后却明显增强rhTRAIL诱导SGC7901细胞凋亡的能力, 值得指出的是两药联用12 h时细胞的凋亡率虽比单用同等浓度TRAIL高, 但统计学分析差异并无显著性.

表1 各处理组SGC7901细胞的生长凋亡率 (mean±SD, %).
分组

处理时间 (h)

12244872
对照3.02±1.222.23±0.093.84±0.934.56±1.05
As2O33.12±0.893.34±0.972.03±0.114.73±1.95
TRAIL21.88±2.28b29.78±3.18b38.56±1.89b43.12±6.23b
As2O3+TRAIL23.78±4.21b36.49±7.12ab47.13±3.44ab55.63±7.16ab
aP<0.05 vs 处理时间相同时单用TRAIL组;
bP<0. 01 vs 处理时间相同时对照组.
2.2 SGC7901细胞表面TRAIL死亡受体表达

各组细胞表面死亡受体TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5表达的流式细胞仪检测结果见表2-3及图1. 结果显示SGC7901细胞表面存在TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5的表达, 并且在As2O3单独或联合rhTRAIL作用24 h后, 两种受体在细胞表面的表达均明显上调; 而两药联用组与单用As2O3组相比, 死亡受体的表达无显著差异, 说明rhTRAIL并不影响As2O3上调SGC7901细胞表面死亡受体表达的效应.

图1
图1 各组细胞处理24 h时流式细胞仪检测细胞表面TRAIL死亡受体表达. 图中阴影部分为特异性荧光, 虚线下空白区为阴性对照荧光.
表2 各处理组SGC7901细胞表面TRAIL R1/DR4表达(mean±SD, MFI).
分组处理时间 (h)
12244872
对照11.12±2.7613.45±3.8113.93±1.8015.23±4.08
As2O314.44±0.2929.44±4.29a35.11±6.34b37.65±6.08b
TRAIL10.89±0.069.60±2.8814.71±0.9212.48±0.97
As2O3+TRAIL13.02±0.7626.14±3.40a36.06±7.22b39.09±5.16b
aP<0.05,
bP<0.01 vs 处理时间相同时对照组.
表3 各处理组SGC7901细胞表面和TRAIL R2/DR5表达(mean±SD, MFI).
分组处理时间 (h)
12244872
对照15.48±1.8816.45±5.0713.24±5.0815.23±2.25
As2O314.72±4.2928.04±0.79a32.11±3.32b30.75±0.12a
TRAIL12.25±3.0614.60±4.4816.07±1.2218.98±0.77
As2O3+TRAIL19.29±7.9731.47±4.56a33.60±4.34b36.89±7.26b
aP<0.05,
bP<0.01 vs 处理时间相同时对照组.
2.3 SGC7901细胞TRAIL死亡受体基因的表达

SGC7901细胞存在TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5 mRNA的表达, 并且在As2O3单独或联合rhTRAIL作用24 h后, 两种受体mRNA水平表达均明显上调. 而单用rhTRAIL作用24 h后, 上述两种死亡受体的mRNA水平未明显上调(图2).

图2
图2 各组细胞处理24 h后RT-PCR检测TRAIL死亡受体mRNA表达. A, E: 对照; B, F: As2O3; C, G: As2O3+TRAIL; D, H: TRAIL; A-D: R1/DR4; E-H: R2/DR5.
3 讨论

到目前为止, 已经发现了5种TRAIL受体, 分别是死亡受体(TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5) 、诱骗受体(TRAIL R3/DcR1和TRAIL R4/DcR2)和可溶性受体OPG. 死亡受体多表达于肿瘤细胞表面, TRAIL与之结合后能诱导细胞凋亡; 而诱骗受体主要表达于正常细胞表面, 由于缺乏胞质段, 不能传递凋亡信号, TRAIL与之结合不能诱导细胞凋亡. 因此, TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用具有一定的选择性, 这意味着其用于临床的可能性远高于FasL, TNF等其他细胞因子类药物, 后者由于非选择性细胞毒作用而未能广泛用于临床[1]. 但目前TRAIL进入临床实验的障碍主要有两个: 一方面, TRAIL仍然面临着化疗药物普遍存在的耐药性难题[2]; 另一方面, 当TRAIL超过一定浓度后, 将丧失对肿瘤细胞的选择性杀伤作用, 诱导正常细胞凋亡而带来副作用[3]. 与此同时, 越来越多的报道显示, 低于常规剂量的化疗药物可以增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性, 在不增加毒性作用的前提下提高疗效. 因此, 探索低毒高效的TRAIL配伍使用方案具有重要的意义[4].

As2O3有广泛而独特的抗癌机制, 对包括胃癌细胞在内的多种肿瘤细胞有诱导凋亡和抑制生长的作用[5]. 但在治疗实体肿瘤的临床实验中却并未取得满意的结果, 原因之一是实体瘤内部血供不均匀, As2O3对于部分肿瘤细胞未能达到有效浓度[6]. 因此, 研究低浓度As2O3对实体瘤细胞的生物学效应有重要意义. 国内邢茂et al[7]的研究表明, 浓度为1 μmol/L的As2O3不影响SGC7901细胞活力, 也不诱导其凋亡, 因而是亚细胞毒性剂量. 本实验将该浓度As2O3和rhTRAIL配伍使用, 观察As2O3在亚细胞毒性剂量下对rhTRAIL诱导肿瘤细胞凋亡作用的影响并探讨了其中的机制. 结果显示1 μmol/L As2O3虽然对SGC7901细胞不具备明显的凋亡诱导作用, 但和500 μg/L rhTRAIL联合使用24 h后SGC7901细胞凋亡率明显高于单用同浓度的rhTRAIL, 显示亚细胞毒性剂量As2O3对SGC7901细胞有增敏作用, 提示两药可能配伍使用治疗胃癌.

肿瘤细胞对TRAIL是否敏感是多种机制决定的, 其中的一个重要的因素是细胞表面死亡受体表达的强度[8]. 本研究采用间接免疫荧光染色方法标记细胞表面的死亡受体, 流式细胞仪检测荧光量直接反映死亡受体在细胞表面的表达情况. 结果发现, As2O3单独或联合rhTRAIL时均可以上调SGC7901细胞表面死亡受体(TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5). 我们认为, 这至少部分的解释了As2O3对SGC7901细胞增敏作用的机制. 值得指出的是: 药物作用12 h时的检测并未发现As2O3明显上调SGC7901细胞表面死亡受体以及对SGC7901细胞有增敏作用, 两者都是发生在药物作用24 h后. 这提示两者的作用是同步的, 前者可能是后者的原因.

为进一步研究As2O3上调SGC7901细胞表面死亡受体的机制, 我们用RT-PCR方法检测了两种死亡受体mRNA在处理前后的表达水平. 结果显示药物处理24 h后死亡受体mRNA表达增强, 与细胞表面死亡受体上调同步. 这与部分增敏剂在不增加死亡受体基因转录和翻译的前提下, 加强死亡受体蛋白向细胞表面转运是不同的[9].

As2O3和TRAIL与传统化疗药相比, 毒性较小, 是未来很有希望的抗肿瘤药物. 本研究证实低浓度As2O3可以增加TRAIL死亡受体(TRAIL R1/DR4和TRAIL R2/DR5)的基因转录、上调细胞表面TRAIL死亡受体表达, 从而使胃癌细胞SGC7901增加对TRAIL敏感性, 提示两药伍用可能成为治疗胃癌低毒高效的新方案.

评论
背景资料

TRAIL作为肿瘤坏死因子家族新成员, 对多种肿瘤细胞有一定的凋亡诱导效应和生长抑制效应, 被认为是有希望应用于临床的细胞因子药物. 但TRAIL仍然面临着抗肿瘤药物普遍存在的耐药性难题和非特异性细胞毒作用带来的副作用. 越来越多的报道显示, 低于常规剂量的化疗药物可以增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性, 在不增加毒性作用的前提下提高疗效. 因而,细胞因子生物治疗联合化疗成为近年国内外肿瘤研究的一个重要方向.

相关报道

Yair Gazitt et al研究发现, As2O3可以上调部分多发性骨髓瘤细胞表面TRAIL死亡受体表达, 从而和TRAIL在诱导细胞凋亡方面形成协同效应.

创新盘点

本研究首次证实亚细胞毒性剂量As2O3增强TRAIL诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的效应, 并从TRAIL死亡受体表达的角度阐述了其中的机制.

应用要点

作为两种低毒的新型治疗药物,TRAIL和As2O3具有良好的临床应用前景, 本研究为两药联用于胃癌治疗提供了一定的实验基础.

同行评价

本课题旨在分析As2O3对rhTRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响及其机制, 探索两者联用于胃癌治疗的可行性. 立题较好,也有一定新意. 研究方法虽相对较单一, 但也可说明一定的问题.

电编:李琪 编辑:张焕兰

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