黄芩甙对ConA致肝损伤小鼠肝组织MDA含量的影响

摘要

目的: 观察黄芩甙对模型小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA含量的影响.

方法: 除正常组灌服及尾静脉注射生理盐水外, 其余各组小鼠分别于首日上、下午和次日下午各灌胃给药1次0.2 mL/只, 联苯双酯为150 g/L, 大、中、小及注射剂组分别为200、100、50、50 g/L. 末次给药后4-6 h各组动物一次性尾静脉注射ConA 20 mg/kg, 观察血清ALT、AST和肝组织MDA含量的变化.

结果: 除空白组外的各组小鼠血清ALT、AST值黄芩甙大(2 321.3±406.2; 1 638.5±353.4)、中(1 890.2±467.3; 1 550.3±437.3)、小剂量组(1 584.7±399.6; 1 302.9±353.1)以及注射剂组(2 570.0±406.7; 2 186.4±443.9)较模型组(4 499.9±334.2; 3 967.6±392.7)均显著降低(P<0.01), 说明各治疗组均有降低转氨酶的作用. 在降低ALT作用方面, 黄芩甙大剂量与注射剂组的ALT降低不及联苯双酯组(P<0.05), 黄芩甙中、小剂量降低ALT的作用与联苯双酯组(1 612.8±309.2)较为接近(P>0.05). 在降低AST作用方面, 黄芩甙大、中、小剂量的作用无明显差异并与联苯双酯较为接近(P>0.05), 同时可以肯定的是, 黄芩甙注射剂也有明显的降低AST的作用, 但效果不如黄芩甙大、中、小剂量和联苯双酯组(P<0.05, P<0.05, P<0.05). 肝组织匀浆中的MDA含量, 以黄芩甙大(2.61±0.3)、中(2.11±0.4)、小剂量组(2.60±0.5)及注射剂(2.66±0.5)和联苯双酯组(2.81±0.3)均较模型组(4.66±0.5)显著降低(P<0.01), 黄芩甙中剂量组的肝匀浆MDA含量最低, 而黄芩甙大、小剂量组及注射剂组的肝匀浆MDA含量低于联苯双酯组, 但组间比较无显著差异(P>0.05).

结论: 黄芩甙可降低血清ALT、AST和肝组织MDA含量且优于联苯双酯, 这可能是其抗ConA肝损伤机理的重要方面.

关键词: 无

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: March 12, 2005
Revised: March 28, 2005
Accepted: April 1, 2005
Published online: May 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

黄芩甙(baicalin, BC)是中药黄芩(scutellaria baicalensis georgi)中的一种主要成分, 黄芩具有清热燥湿、泻火解毒的功能, 可用于湿热所致的多种病症. 据报道黄芩甙有较好的解热、抗菌消炎、解毒、抗氧化、抗病毒、抗感染、调节免疫等药理作用, 以往国内临床主要用于抗菌消炎和抗感染, 近年来多运用于各种疾病见有湿热邪毒证候, 如感冒、发热、呼吸系统炎症、慢性肝炎、黄疸、胆囊疾病、肾脏疾病等. 由于肝组织损伤与病毒感染、炎症、过氧化反应、自身免疫系统失衡等息息相关, 因此应用黄芩甙防治免疫原因造成的肝损害对治疗病毒性肝炎的研究有重要意义. 我们建立ConA致小鼠肝损伤的动物模型, 以联苯双酯为对照, 通过对肝损伤小鼠血清的AST、ALT, 肝组织的MDA含量的检测, 探讨黄芩甙可能的保肝降酶、抗氧化、防止肝损伤的作用和机理.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物: 黄芩甙(C21H18O11), 分子质量为446.35 u, 由朱宇同教授馈赠, 经聚酰胺薄层层析、紫外可见光谱证实纯度达到98.9%以上.

1.1.2 实验动物: 雄性Balb/c小鼠95只, 体重20-22 g, 8-9周龄, 购自第一军医大学实验动物中心.

1.1.3 主要试剂: ConA为美国华盛顿生物药品公司生产; 联苯双酯自北京协和药厂生产. ALT、AST试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司生产. MDA和双缩脲蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

1.1.4 主要仪器: 玻璃匀浆器; 752型紫外光栅分光光度计; HH-S11.2电热恒温水浴器; 小型三用水箱; TD5台式离心机; TLL-D台式冷冻离心机、台式高速离心机.

1.2 方法

1.2.1 动物分组: 小鼠适应性喂养3 d后, 将动物随机分为7组, 分别为正常组10只、病理组15只、联苯双酯组14只、黄芩甙大剂量、中剂量、小剂量及注射剂组各14只.

1.2.2 模型复制: 按文献[1]方法, 除正常对照组灌服及尾静脉注射生理盐水外, 其余各组小鼠分别于首日上、下午和次日下午各灌胃给药1次0.2 mL/只, 联苯双酯为150 g/L, 大、中、小及注射剂组分别为200、100、50、50 g/L. 末次给药后4-6 h各组动物一次性尾静脉注射ConA 20 mg/kg.

1.2.3 标本采集: 尾静脉注射ConA 12 h后, 摘眼球取全血, 低温条件下处死动物, 摘取肝脏观察大体外观后, 取同一肝叶用40 g/L中性甲醛溶液固定, 其余部分-20℃冻存备用.

1.2.4 小鼠肝组织匀浆制备: 将Tris1.21 g及EDTA-2Na 37.23 mg加蒸馏水500 mL, 再用200 mmol/L HCl进行滴定至pH7.4, 然后加入3.42 g蔗糖, 再加水至1 000 mL, 分装、高压灭菌后即为匀浆递质, 放4℃冰箱中备用. 取冰冻小鼠肝组织, 用冰盐水漂洗, 吸水纸吸干, 称取0.2 g放入5-10 mL小烧杯中. 加入的匀浆递质量为肝组织块重量9倍(W: V = 1: 9). 用滴管取总量2/3的匀浆递质移到小烧杯内, 小烧杯置冰水中, 尽快剪碎组织块并倒入匀浆器中, 用剩余的1/3匀浆递质冲洗小烧杯并倒入匀浆管, 再将匀浆器下端插入盛有冰水混合物的烧杯中, 将捣杆垂直充分研磨数10次使组织匀浆化, 继以3 000-4 000 r/min离心10-15 min, 轻轻吸取适量上清液进行各种测定.

1.2.5 一般情况观察: 精神、活动、饮食、皮毛、体重.

1.2.6 ALT、AST测定(赖氏法): 摘眼球取血后, 将血液放置约1 h, 3 000 r/min离心10 min, 轻轻吸取上清, 按试剂盒说明以752分光光度计比色法测定和计算出相应ALT和AST的酶活力单位值.

1.2.7 肝组织MDA含量的检测: 按照说明书步骤, 将样品和各种试剂依次加入试管, 用保鲜膜封闭管口后刺一小孔, 95℃水浴40 min, 取出后流水冷却, 3 500-4 000 rpm离心10 min, 取上清, 532 nm波长、1 cm光径、蒸馏水调零, 比色法测各管吸光度值, 根据计算公式求出各样本中的MDA含量. 肝组织匀浆的蛋白含量测定采用双缩脲法.

统计学处理 采用单因素多个均数比较的方差分析统计法, 在作方差齐性检验后, 进行各组数据两两之间的均数比较, 使用SPSS10.0统计学软件处理.

2 结果

2.1 一般情况

实验期间正常组动物精神充沛, 活跃灵活, 饮食正常, 皮毛整洁, 无死亡; 其余各组在用药后均有少量死亡(黄芩甙中剂量和注射剂组各死亡3只, 小剂量组和联苯双酯组各死亡2只), 以模型组和黄芩甙大剂量组明显(各死亡4只), 同时各组有不同程度的精神萎靡, 活动迟钝, 饮食减少, 皮毛凌乱等表现. 实验期间, 黄芩甙中、小剂量及注射剂组和联苯双酯组动物的精神、饮食等整体情况明显优于病理组和黄芩甙大剂量组, 但较正常组稍差.

2.2 各组血清ALT及AST比较(表1)

表1 实验末各组小鼠血清ALT、AST和MDA含量比较(mean±SD).

组别	n	ALT(nkat/L)	AST(nkat/L)	MDA(nmol/mgprot)
空白对照组	10	349.2±169.5	316.7±223.9	1.98±0.6d
病理模型组	10	4 499.9±334.2b	3 967.6±392.7b	4.66±0.5b
联苯双酯组	12	1 612.8±309.2bd	1 397.6±483.9bdg	2.81±0.3bdg
大剂量组	10	2 321.3±406.2bdek	1 638.5±353.4bdg	2.61±0.3bdk
中剂量组	11	1 890.2±467.3bdgi	1 550.3±437.3bdg	2.11±0.4dfhi
小剂量组	12	1 584.7±399.6bdgi	1 302.9±353.1bdg	2.60±0.5bdk
注射剂组	11	2 570.0±406.7bdek	2 186.4±443.9bdeik	2.66±0.5bdk

^aP<0.05;

^bP<0.01 vs空白组; ^cP<0.05;

^dP<0.01vs病理模型组;

^eP<0.05;

^fP<0.01vs联苯双酯组;

^gP<0.05;

^hP<0.01 vs注射剂组;

ⁱP<0.05; ^jP<0.01 vs大剂量组;

^kP<0.05; ^lP<0.01 vs中剂量组; 未标明则为P>0.05.

与空白组比较, 各组的ALT、AST和MDA均明显高于空白组(P<0.01), 说明造模成功.黄芩甙大、中、小剂量组以及注射剂组均能显著降低小鼠血清ALT、AST. 根据以上数据比较可知, 黄芩甙有肯定的降低ALT、AST作用, 并且不同剂量和不同给药方式的作用效果有一定差别, 黄芩甙中、小剂量同时降低ALT、AST的作用优于其大剂量和注射剂, 并且比较接近目前公认的降转氨酶药联苯双酯. 同时, 黄芩甙大、中、小剂量组及注射剂和联苯双酯组肝匀浆中的MDA含量均较模型组显著降低, 黄芩甙大、小剂量组及注射剂组的肝匀浆MDA含量却低于联苯双酯组, 但组间比较无显著差异(P>0.05), 而黄芩甙中剂量组的肝匀浆MDA含量最低, 说明其降低肝匀浆MDA含量的作用最佳.

3 讨论

中药黄芩是唇形科植物黄芩的根, 主含黄酮类成分, 已分离出约40种黄酮, 主要有黄芩甙、黄芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)等, 其中以黄芩甙的含量最丰富. 现代药理学研究表明[2], 黄芩可不同程度的抑制花生四烯酸(AA)代谢的多个环节, 具有显著的抗炎和抑制多型变态反应的作用; 黄芩能改善和调节脂质代谢, 具有显著的抗氧化作用, 能抑制过氧化脂质的生成, 清除自由基; 其次, 黄芩有较好的保肝、促进胆汁分泌的作用, 同时有显著的降压活性, 以及解热、利尿、抗癌、镇静、抗病原微生物、解毒等功用.黄芩甙具有黄芩的基本作用, 并体现出其更显著的抗氧化、抗病毒、调节免疫、解热、抗感染等药理作用.

刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素, 是一种能在体外激活T细胞的丝裂原, 他进入循环后首先活化肝细胞中的T淋巴细胞, 继而激活肿瘤坏死因子(TNF)和白介素2等细胞因子, 引发炎症反应, 可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用, 通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞[3]. 与其他实验动物模型相比, ConA肝损伤模型被认为更加近似的模拟人类病毒性肝炎和自身免疫性肝病等病理过程[4-5], 其病变与人类慢性肝炎非常接近, 并且有肝脏特异性和靶向性.

本实验结果显示, 模型组较正常组ALT、AST显著升高, 统计学比较有显著性差异, 结合病理组织学检查, 说明ConA所致小鼠肝损伤模型的复制较为成功.黄芩甙大、中、小剂量组以及注射剂组均能显著降低由ConA所致的小鼠血清ALT、AST的升高.黄芩甙中、小剂量降低ALT的作用与联苯双酯较为接近, 黄芩甙大剂量与注射剂也有明显的降低ALT的作用, 但作用效果不如黄芩甙中、小剂量和联苯双酯组. 在降低AST作用方面, 黄芩甙大、中、小剂量的作用无明显差异并与联苯双酯较为接近, 同时可以肯定的是, 黄芩甙注射剂也有明显的降低AST的作用, 但效果不如黄芩甙大、中、小剂量和联苯双酯组. 由此可知, 黄芩甙有肯定的降低ALT、AST作用, 并且不同剂量和不同给药方式的作用效果有一定差别, 本实验结果提示, 黄芩甙中、小剂量同时降低ALT、AST的作用优于其大剂量和注射剂, 并且比较接近目前公认的降转氨酶药联苯双酯.

肝组织匀浆中的MDA含量, 以黄芩甙大、中、小剂量组及注射剂和联苯双酯组均较模型组显著降低, 黄芩甙中剂量组的肝匀浆MDA含量最低, 而黄芩甙大、小剂量组及注射剂组的肝匀浆MDA含量低于联苯双酯组, 但组间比较无显著差异, 结果提示黄芩甙中剂量组降低肝匀浆MDA含量的作用最佳.

肝细胞是肝脏中数目最丰富和最主要的细胞, 也是各种活性氧(reactive oxygen species, ROS)攻击的主要目标, 氧自由基的损伤作用是肝炎发生的重要机制之一. 机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基, 能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)引发脂质过氧化反应, 生成的脂质过氧化物如: MDA、酮基、羟基、氢过氧基或内过氧基, 以及新的氧自由基等, 脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂即非自由基性的脂类分解产物, 而且通过链式或链式支链式反应放大活性氧作用. 肝细胞膜在受损伤的同时可产生大量新的活性氧基团, 促发脂质过氧化的链式反应, 因此而产生的脂质过氧化物可以损伤肝脏中的各种细胞, 故肝细胞膜的脂质过氧化是肝细胞损伤时的主要作用机制之一. 脂类分解产物中的一部分是无害的, 但一部分能引起细胞代谢及功能障碍甚至细胞死亡. 氧自由基不但通过生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化引起细胞损伤, 还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤. 因而测试MDA的含量可反映体内脂质过氧化的程度, 间接反映出细胞损伤的程度.

以上表明, 黄芩甙的不同剂量组和不同剂型组均能降低血清ALT、AST, 可以有效降低肝组织匀浆的MDA含量. 因此推测, 降低转氨酶、抗脂质过氧化, 防止过氧化损伤, 减少过氧化脂质的生成等可能是黄芩甙抗ConA致肝损伤作用机理的重要方面.

虽然本研究结果证实黄芩甙的抗肝损伤与降酶、抗氧化作用密切相关, 但ConA诱导的是典型的T细胞依赖性肝损害, 多种细胞因子参与了肝损害病理过程, 黄芩甙本身还具有抗炎、抗变态反应、调节免疫、抗病毒、解毒、利胆等药理学作用, 黄芩甙抗ConA肝损伤的作用是否也与这些因素有关. 因此, 黄芩甙的具体和确切的生物学作用还有待于将来做深入研究.

备注

编辑: 张海宁

参考文献

1.	赵 冬梅, 刘 耕陶. 双环醇对刀豆蛋白A所致小鼠肝细胞核DNA损伤的保护作用. 中华医学杂志. 2001;81:844-848.  [PubMed]  [DOI]

2.	王 浴生, 邓 文龙, 薛 春生.  中药药理与应用. 第二版, 北京: 人民卫生出版社 1998; 972-982.  [PubMed]  [DOI]

3.	Ksontini R, Colagiovanni DB, Josephs MD, Edwards CK 3rd. Tannahill CL, Solorzano CC, Norman J, Denham W, Clare-Salzler M, MacKay SL, Moldawer LL. Disparate roles for TNF-α and Fas ligand in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 1998;160:4082-4089.  [PubMed]  [DOI]

4.	Gantner F, Leist M, Lohse AW, Germann PG, Tiegs G. Concanavalin A-induced T-cell-mediated hepatic injury in mice: the role of tumor mecrosis factor. Hepatology. 1995;21:190-198.  [PubMed]  [DOI]

5.	Küsters S, Gantner F, Künstle G, Tiegs G. Interferon gamma plays a critical role in T cell-dependent liver injury in mice initiated by Concanavlin A. Gastroenterology. 1996;111:462-471.  [PubMed]  [DOI]