NHE1基因调控细胞内酸碱平衡对胃癌细胞生物学行为的影响

摘要

目的: 通过基因转染技术, 研究NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞生物学行为的影响, 探讨通过酸化细胞内环境诱导肿瘤细胞凋亡从而治疗胃癌的新方法.

方法: 利用亚克隆技术构建人NHE1反义结构基因哺乳动物真核表达质粒, 通过DOTAP脂质体介导的转染技术将反义真核表达质粒和空载体分别转入SGC-7901胃癌细胞中, 经聚合酶链反应(PCR)对转染基因的整合鉴定后, 观察基因转染对细胞形态学、细胞内pH值、体外生长状况、细胞周期以及双层软琼脂克隆形成能力和裸鼠成瘤力的影响.

结果: 光镜及透射电镜下细胞形态恶性程度降低. Anti-7901细胞胞内pH值显著低于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞内pH值(6.77±0.05 vs 7.24±0.03, 7.26±0.03, P<0.01). Anti-7901细胞生长速度明显减慢, 出现接触抑制, 呈单层生长, 细胞凋亡率显著高于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901凋亡率(26.1% vs 5.12%, 4.48%, P<0.01). Anti-7901细胞在双层软琼脂中集落形成率显著低于Zeo-7901和空白对照组SGC-7901细胞(9±3.54‰ vs 40±4.53‰, 38.6±4.63‰, P<0.01). 接种Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞裸鼠皮下长出肿瘤, 成瘤率为100%, 而接种Anti-7901细胞裸鼠皮下未长出肿瘤, 成瘤率为0%.

结论: 反义技术干预可使NHE1基因表达下调, 导致细胞内酸化, 诱导细胞凋亡, 达到了有效治疗胃癌的目的, 为胃癌基因治疗提供了新的思路.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 7, 2004
Revised: December 12, 2004
Accepted: December 28, 2004
Published online: February 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

胞膜离子交换蛋白Na+-H+交换泵(Na⁺-H⁺ exchanger, NHE)是存在于所有真核细胞的一种跨膜蛋白, 是维持细胞内pH值(intracellular pH, pHi)在中性或偏碱性的重要膜蛋白[1]. 近年来, 随着对NHE1研究在肿瘤学领域的不断深入, 人们发现NHE1基因在肿瘤细胞中的活性明显增高, 使肿瘤细胞内pH值为中性或偏碱性, 与肿瘤的发生有着密切的关系[2]. 已有研究证实, pHi下降促进细胞凋亡, pHi升高抑制凋亡的发生[3]. 因此阻断肿瘤细胞NHE1基因的表达, 导致肿瘤细胞内酸化, 诱导细胞凋亡, 不失为抗肿瘤治疗的新途径, 具有重要的理论意义和实践意义. 我们前期研究发现[4], 在慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生组织中均可检测到NHE1蛋白的表达, 而且随着病变程度的增加, NHE1表达有增加的趋势, 提示NHE1超表达的细胞, 可能是一种癌前细胞, 与胃癌的发生有着密切的关系. NHE1 mRNA及其蛋白在胃癌中的表达程度显著高于胃癌前病变, 提示NHE1基因可能是基因治疗胃癌的一个理想靶点.

1 材料和方法

1.1 材料

E.Coli DH5a细菌由第三军医大学西南医院烧伤研究所实验室提供; 基因表达质粒PECE(PEAP-NHE1)由加拿大Jossete Noel(Montreaty University)博士惠赠, 全长6.5 kb, 携带包含人类NHE1结构基因的3.6 kb cDNA目的片段, 经EcoRI、HindШ位点插入(5ˊ含HindШ酶切位点, 3ˊ含EcoRI酶切位点), 含有Amp标志基因; 哺乳动物真核表达载体pcDNA3.1(-)/Zeo为Invitrogen公司产品, 含EcoRI、HindШ酶切位点(5ˊ含EcoRI酶切位点, 3ˊ含HindIII酶切位点); 限制性内切酶EcoRI、HindШ购自Takara公司; T4 DNA连接酶为Promega公司产品; 转染细胞筛选所用抗生素Zeocin为Invitrogen公司产品; 转染用脂质体DOTAP为Roche公司产品; DNA回收试剂盒由金泰生物技术(厦门)有限公司惠赠; 快速质粒提取盒E.Z.N.A^®lasmid Miniprep Kit I为omega Bio-Tek公司产品; BCECF荧光探针购自Eugene公司; Nigericin购自Sigma公司; Zeocin PCR引物根据文献由上海基康公司设计合成.

1.2 方法

采用亚克隆重组技术进行基因重组, pcDNA3.1(-)/Zeo用EcoRI、HindШ酶切后, 等体积酚/氯仿抽提1次, 离心沉淀, 用去离子水溶解, 取1 mL电泳, 余置-20 ℃备用. PECE用EcoRI、HindIII酶切电泳后, 试剂盒回收目的片段, 目的片段与酶切后pcDNA3.1(-)/Zeo在T4DNA连接酶作用下, 进行定向反向连接, 在16 ℃条件下连接16 h, 然后进行酶切凝胶电泳鉴定. 重组成功后, 采用脂质体法将质粒转染至SGC-7901胃癌细胞中. 采用PCR法扩增外源性ZeoR基因来鉴定转染成功. SGC-7901胃癌细胞在100 mL/L小牛血清1640培养基中, 于37 ℃, 50 mL/L CO₂, 饱合湿度下培养. 用缓冲液求细胞内pH值的标准曲线, 缓冲液内含(Mm): KCl 90-130, NaCl₅, MgSO₄ 1, CaCl₂ 1, HEPES 10, 将缓冲液分装6只试管中, 每只5 mL, 分别将pH调至不同的值, 分别为5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 6只试管中分别加入Nigericine和BCECF, 浓度分别为30 mmol/L和0.25 mmol/L, 将转染后48 h的细胞PBS洗2次, 分别将相同数量的细胞加入上述试管中, 37 ℃孵育12 min, 用氩离子激光488 nm激发, 记录530/640发射荧光, 求出该比值(FIR), 以pH值为横坐标, FIR为纵坐标, 求出标准曲线, 根据标准曲线求出细胞内pH值[5]. 细胞周期及细胞凋亡用流式细胞仪检测. 利用酶联免疫吸附仪测定各细胞的吸光度值, 绘制细胞生长曲线. 光镜和透射电镜观察细胞结构的变化. 镜下计数软琼脂中细胞集落形成数, 镜下直径大于75 mm或细胞数大于50个以上的克隆才计数, 求出克隆形成率. 裸鼠皮下分别接种Zeo-7901细胞、空白对照组SGC-7901和Anti-7901细胞悬液, 观察裸鼠体内成瘤情况.

统计学处理 计量数据以平均数北曜疾(mean±SD)表示, 对相关资料进行t 检验, 采用SPSS程序包进行分析, P<0.05为差异显著, P<0.01为差异非常显著.

2 结果

2.1 基因重组及鉴定

pEAP-NHE1用EcoRI、HindIII酶切后, 形成2.9 kp和3.6 kp两条带. 根据对pEAP-NHE1质粒图谱的分析, 用凝胶试剂盒回收含人类NHE1结构基因cDNA的3.6 kp目的片段. pcDNA3.1(-)/Zeo用EcoRI、HindШ酶切后, 形成5.0 kp的线性载体. 将其与目的片段进行定向反向连接, 并经细菌转化和质粒抽提, 获的重组质粒, 再用EcoRI、HindШ酶切后, 形成5.0 kp、3.6 kp条带, 提示目的片段成功插入载体中. 采用脂质体法将反义重组质粒及空载体转染至SGC-7901胃癌细胞中, Zeocin筛选出稳定的克隆后, NHE1反义基因转染的SGC-7901细胞命名为Anti-7901细胞, 空载体pcDNA3.1(-)/Zeo转染的SGC-7901细胞命名为Zeo-7901细胞. 采用PCR法扩增外源性ZeoR基因, 转染反义重组质粒及空载体的SGC-7901胃癌细胞组可各见一条特异性条带, 大小为357 bp, 而空白对照组SGC-7901胃癌细胞未见特异性条带, 说明反义重组质粒及空载体已转染至胃癌细胞内.

2.2 细胞形态学的变化

光镜下观察: Anti-7901细胞胞体增大, 胞质丰富, 核大小相对一致, 核浆比减少, 核分裂相减少, 异型性减小. 而Zeo-7901和空白对照组SGC-7901细胞胞体大小不一, 形态多样, 胞质少, 核大小不一, 核浆比增大, 核分裂相增多, 异型性增大, 出现较多巨核细胞和多核巨细胞. 空白对照组SGC-7901和空载细胞相比无明显差别. 透射电镜下观察: 空白对照组SGC-7901细胞和空载细胞核大, 核仁突出, 核膜有皱缩, 细胞器不发达, 线粒体少, 形状不规则, 少见粗面内质网, 可见大量的游离核糖体. 而Anti-7901细胞器发达, 线粒体丰富, 形态较为成熟, 并可见髓鞘样变, 胞质内出现空泡样结构, 高尔基体较发达, 内质网扩张, 核偏向一侧, 极性增强.

2.3 细胞内pH的测定

以横坐标为pH值, 纵坐标为发射荧光比值(FIR), 求出标准曲线, 回归方程: y = 0.2 144c-0.4 248(r = 0.96), 根据标准曲线求出的Anti-7901细胞胞内pH值为6.770.05, 而Zeo-7901细胞和 空白对照组SGC-7901细胞内pH值分别为7.240.03和7.260.03, 统计学分析有显著差异(P<0.01).

2.4 细胞周期及细胞凋亡检测

流式细胞仪检测显示, Anti-7901细胞凋亡率为26.1%, 显著高于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞凋亡率(5.12%, 4.48%, P<0.01). Anti-7901细胞增生指数为40.43%, 低于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞增生指数(45.48%, 44.86%), 但无统计学差异. Anti-7901细胞G0/G1期细胞较Zeo-7901细胞和SGC-7901轻度增加, S和G2M期细胞轻度减少.

2.5 生长曲线

生长曲线显示, Anti-7901 细胞较Zeo-7901细胞及空白对照组SGC-7901细胞在增生速度上明显减慢. 在倒置显微镜下观察发现Anti-7901细胞有明显的接触抑制现象, 细胞失去重叠生长的能力, 且易发生脱落, 而Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞则重叠生长显著, 细胞丧失接触抑制.

2.6 软琼脂克隆形成率

软琼脂中培养, 2 wk左右可见空白对照组SGC-7901细胞和Zeo-7901细胞成簇生长, 且集落大, 数目增多, 形成率分别为38.64.63‰、404.53‰, 而Anti-7901细胞在软琼脂中可见散在的细胞, 形成集落少, 形成率为93.54‰, 显著少于SGC-7901细胞和Zeo-7901细胞(P<0.01).

2.7 裸鼠体内致瘤性分析

在接种细胞约4106个/只裸鼠的情况下, 6 wk后接种Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞的3只裸鼠右下侧皮下长出肿瘤, 成瘤率为100%, 而接种Anti-7901细胞的3只裸鼠右上侧皮下未长出肿瘤, 成瘤率为0%.移植瘤HE染色, 细胞胞体大小不一, 胞质少, 核大小不一, 核浆比增大, 核分裂相多, 异型性大, 出现较多巨核细胞和多核巨细胞.

3 讨论

胃癌是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一, 其死亡率在我国居恶性肿瘤的首位. 和其他恶性肿瘤一样, 原癌基因的激活、抑癌基因的突变是胃癌形成的重要分子基础之一, 但胃癌的基因异常大多缺乏特异性, 因此胃癌发生的分子机制仍然模糊不清[6]. 近年研究发现, 细胞凋亡异常在肿瘤发生发展过程中具有重要的意义, 胃黏膜癌变过程中不仅存在细胞过度增生, 同时存在细胞凋亡异常, 细胞凋亡与细胞增生平衡失调在胃癌发生中具有重要意义[7-8]. 对肿瘤的治疗可以通过诱导肿瘤细胞凋亡, 而不单是抑制肿瘤的增生来实现.

自1989年Sardet实验室成功克隆人类NHE1 cDNA以来[9], 人们已知NHE有8个亚型, 分别命名为NHE1-8, 他们在结构上相似, 功能上相关, 共同构成膜交换蛋白的一个基因家族[10-13]. NHE1主要存在于人类的所有组织中, 是一种管家基因, 定位于1P35-36座位上, mRNA为3.8 kb. 人类NHE1基因由12个外显子和11个内含子组成, cDNA全长为5 kb, 开放阅读框长2 445 bp[14]. 我们前期研究发现[4], NHE1基因表达在胃癌中显著增加, 与胃癌的发生有着密切的关系. 为进一步了解NHE1基因在胃癌细胞中的作用, 探讨通过使细胞内酸化来诱导肿瘤细胞凋亡从而治疗胃癌的新方法, 我们利用基因转染技术, 构建NHE1反义真核表达载体, 将NHE1反义基因转染入SGC-7901胃癌细胞, 研究NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞生物学行为的影响.

在实验中我们成功构建了NHE1反义基因哺乳动物真核表达质粒, 并成功转染SGC-7901胃癌细胞. 首次发现转染NHE1反义基因后, SGC-7901胃癌细胞细胞器发生数量和形态学方面的变化, 胃癌细胞形态恶性程度降低. 转染NHE1反义基因后, SGC-7901胃癌细胞生长速度明显减慢, 出现接触抑制, 呈单层生长, 增生指数降低, 细胞凋亡增加, 细胞周期左移, 在软琼脂培养其中的生长能力降低, 裸鼠体内致瘤能力显著降低. 提示NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞的恶性行为有明显抑制作用. NHE1基因在胃癌中表达增加, 形成细胞内碱外酸的微环境, 可能是胃癌细胞增生、逃避凋亡的主要机制之一.

NHE1基因的超表达对癌细胞的pHi调节发挥重要作用, 癌细胞通过增加胞膜上NHE1的数量分布, 从而加强Na+-H+交换, 是其pHi调节的主要分子机制和特点, 对维持其pHi稳定及恶性生长具有重要的生物学意义[15]. 由于Na+-H+交换依赖于Na⁺-K⁺-ATP酶供能, 这一耗能过程又反馈地刺激癌细胞对糖的摄取和对糖酵解的依赖, 胞内H+不断增多, 从而使肿瘤细胞进行强大的Na⁺-H⁺交换, 将大部分H+泵出细胞外, 形成肿瘤细胞组织间液的酸性环境, 保持肿瘤细胞内pH为中性或偏碱性, 从而使肿瘤细胞免遭凋亡. 我们通过转染NHE1反义基因成功抑制了SGC-7901胃癌细胞的NHE1基因表达, 使胃癌SGC-7901细胞内酸化, 其Anti-7901细胞pHi值较SGC-7901胃癌细胞、Zeo-7901细胞明显降低. NHE1基因表达受限的胃癌细胞增生受抑, 凋亡率增加, 细胞恶性程度降低, 裸鼠体内致瘤能力显著降低. 表明转染的人NHE1反义基因成功抑制了Na⁺-H⁺交换, 破坏了胃癌细胞的能量代谢模式, 达到了有效治疗胃癌的目的. 我们的结果证实了通过使细胞内酸化诱导细胞凋亡从而治疗胃癌的可行性, 为胃癌基因治疗提供了新的思路.

备注

编辑:张海宁

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