补脾方药血清对离体脾虚大鼠壁细胞胞内[Ca2+]i的影响

摘要

目的: 探讨脾虚状态的分子病理机制及补脾方药对其的影响.

方法: 采用血清药理学方法对分离后的大鼠壁细胞在体外给药, 并用荧光指示剂Fura-2/AM负载细胞, 使用双波长荧光分光光度计分别检测静息状态下壁细胞内的[Ca²⁺]i及胃泌素负荷后[Ca²⁺]i动态变化情况.

结果: 静息状态下, 脾虚模型组大鼠壁细胞胞内[Ca²⁺]i(64.32±12.82)明显低于正常组(76.64±14.21)(P<0.05), 加入胃泌素(终浓度100 nM)后, 胞内[Ca²⁺]i的增高幅度模型组(13.43±2.70)明显大于正常组(9.80±2.12)(P<0.01); 脾虚大鼠经补脾方药血清作用后各组的静息状态下[Ca²⁺]i均介于正常组与模型组之间, 胃泌素刺激后胞内[Ca²⁺]i的增高幅度也有不同程度的减小, 其中党参治疗组的增高幅度(11.13±2.46)与模型组(13.43±2.70)相比差异显著(P<0.05).

结论: 脾虚大鼠壁细胞胞内静息状态下[Ca²⁺]i降低和胃泌素刺激后胞内[Ca²⁺]i的异常变化可能是脾虚证病理机制之一, Ca²⁺可能在分子水平上参与了脾虚证的形成.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: November 18, 2004
Revised: December 2, 2004
Accepted: December 8, 2004
Published online: February 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

我室自1999年建立大鼠壁细胞的分离和纯化方法后, 对脾虚证与壁细胞的关系进行了一系列的研究. 前期我们分别采用整体和离体实验对大黄脾虚模型大鼠及补脾方药作用后的壁细胞胃泌素受体结合容量及亲和力进行了初步探讨, 结果表明, 脾虚大鼠胃泌素受体结合容量降低而亲和力升高. 为进一步从分子水平上深入揭示脾虚病理机制, 建立大鼠壁细胞的体外研究方法, 本实验又在原有基础上采用血清药理学方法对胞内受体后信号转导枢纽- Ca²⁺进行了研究.

1 材料和方法

1.1 材料

Sprague-Dawley♂大鼠, 体重200±20 g, 由广州中医药大学实验动物中心提供, 动物合格证号: scxk(粤)2003-0001. 试剂: 链霉蛋白酶(Sigma)、[Leul5]-胃泌素(Sigma)、Fura-2/AM(Biotium)均购于北京鼎国生物有限责任公司; Percoll(Pharmacia)购于华美生物工程公司. 主要仪器与设备: LS55荧光分光光度计(Perkinelmer), HZS-H恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子有限公司), XDS-1倒置显微镜(重庆光电仪器厂), TDZ5-WS自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器公司), 多头磁力搅拌器(常州国华电器厂).

1.2 方法

1.2.1 药物及含药血清的制备: 补中益气汤依中国药典的处方, 采用常规方法制备成100%水提液, 党参、白术制备成66%水提液; 按l mL/l00 g, 连续给药5 d, 1次/d, 空白血清组给予等量的蒸馏水, 末次给药后2 h, 眶静脉丛穿刺采血, 室温静置2 h后, 3 000 r/min, l0 min, 离心分离血清, 0.22微孔滤膜过滤除菌, 置冰箱中保存备用[1-2].

1.2.2 动物分组与造模: 大鼠随机分成正常对照和大黄脾虚组, 模型的制备采用我室常规方法, 大黄脾虚组用100%大黄水浸液l mL/100 g灌胃大鼠, 2次/d, 连续10 d, 正常对照组给予等量蒸馏水. 以上各组均常规喂养, 自由饮水, 第11 d 处死动物, 分离壁细胞.

1.2.3 大鼠壁细胞的分离与纯化: 在本室以往基础上加以改进[3]: 大鼠脱颈椎处死, 剖腹取胃, 结扎贲门和幽门. 在胃底部做一小切口, 用玻璃棒将胃袋翻转, 然后在胃底与胃体之间结扎, 弃去胃底, 用生理盐水将胃袋冲洗干净. 把预先配制好的链酶蛋白酶(Pronase)液约2.5 mL(1g/L)注入胃袋. 然后将胃袋放入预先通氧的Medium A(MA)中37 ℃水浴消化30 min后转入Medium B(MB)中37 ℃用磁力搅拌器搅拌两次, 各10 min, 收集每次MB中打下的细胞悬液; 再重新将胃袋放入新鲜的MA中孵育20 min, 用新鲜的MB搅拌两次, 各10 min, 每次收集MB中打下的细胞悬液; 然后再次将胃袋放入新鲜的MA中孵育10 min, 用新鲜的MB搅拌两次, 各10 min, 每次收集MB中打下的细胞悬液. 所有收集到的细胞悬液均用200目尼龙网过滤, 过滤液4 ℃1 000 r/min离心5 min, 倾出上清夜, 沉淀用MediumC(MC)混悬以供纯化. 孵育过程皆充以950+50mL/LCO2. 取10 mL 专用离心管, 用吸管在管底分别铺2 mL预先配制好的60%和40%Percoll液制成不连续密度梯度分离液, 将细胞悬液1 mL左右铺在最上层, 然后4 ℃、2 000 r/min、离心20 min进行纯化, 收集40%与60%Percoll交界面处的壁细胞, MC洗两次, 再用MC混悬备用.

1.2.4 壁细胞Fura-2/AM的负载及加药[4]: 将纯化后的模型组细胞悬液随机分为脾虚模型组、补中益气汤治疗组、党参治疗组及白术治疗组. 将细胞悬液的浓度调整约为1.5×10⁹ cells/L, 正常及脾虚组给予终浓度200 mL/L的空白血清, 补中益气汤、党参及白术治疗组分别给予等量的药物血清, 37 ℃作用20 min. 用MC液洗两次后, 加入终浓度1 mmol/L的Fura-2/AM, 37 ℃避光孵育45 min, 然后加入MC液重复两次洗去残存细胞外液的Fura-2/AM, 重新加入2 mLMC液调整细胞数至l.5×10⁹cells/L备用.

1.2.5 壁细胞胞内[Ca²⁺]i的测定[5-6]: 将负载Fura-2的细胞悬液2 mL加入双波长荧光分光光度计的专用石英杯内, 分别测定给药前后的荧光强度变化. 测定参数为: 激发波长340 nm和380 nm, 发射波长510 nm, 狭缝5 nm. Ca²⁺浓度的计算公式如下: [Ca²⁺]i = Kd(Sf2/Sb2)碵(R-Rmin)/(Rmax-R)], 其中Kd: Fura-2与Ca²⁺反应的解离常数, 为224 nmol/L; R: 每次所测得的荧光比值; Sf2: 在无Ca²⁺状态下380 nm激发的荧光强度; Sb2: 在饱和Ca²⁺状态下380 nm激发的荧光强度; Rmax: 指Fura-2的所有结合部位均为Ca²⁺所饱和, 即缓冲液中加终浓度1 mL/L的TritonX-100所测得的340 nm/380 nm; Rmin: 指所有Fura-2均为游离形式时所测得的荧光比值, 即过量的EGTA存在下(本实验终浓度为5 nmol/L, pH>8.5)所测得的340 nm/380 nm(注: 在计算Ca²⁺之前, 均减去在没有负载Fura-2/AM的细胞中测到的自发荧光).

统计学处理 采用统计软件SPSS11.0分析, 实验数据均以mean±SD表示, 用t检验处理, P<0.05为有统计学差异.

2 结果

静息状态下, 脾虚模型组大鼠壁细胞胞内[Ca²⁺]i明显低于正常对照组(P<0.05), 各治疗组介于脾虚模型组与正常对照组之间; 加入胃泌素后, 细胞内[Ca²⁺]i均有所升高, 但模型组升高幅度明显高于正常组(P<0.01), 各治疗组的增高幅度处于二者之间, 其中党参治疗组与模型组相比差异显著(P<0.05)(表1).

表1 静息状态[Ca²⁺]i及胃泌素刺激后壁细胞内[Ca²⁺]i 变化.

组别	n	[Ca2+]i (nmol/L, mean±SD)		增高幅度(%)
		静息状态	Gastrin 刺激后
正常对照组	15	76.64±14.21	84.15 ±15.53	9.80±2.12
脾虚模型组	15	64.32±12.82a	72.96±13.96a	13.43±2.70b
补中益气汤治疗组	15	67.14±13.35	75.24±14.06	12.06±2.31
党参治疗组	15	69.75±13.25	77.51±13.54	11.13±2.46c
白术治疗组	15	66.08±10.88	74.37±11.61	12.55±3.19

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs正常对照组;

^cP<0.05 vs脾虚模型组.

3 讨论

Ca2+是细胞内最重要的第二信使, 参与和调节多种生理和生化过程, 细胞内[Ca²⁺]i的变化可引起广泛的细胞效应[7]; 很多疾病或病理现象的产生均伴随着胞内Ca²⁺浓度的异常, 如心脑血管缺血缺氧、高血压、痴呆、糖尿病等均与胞内Ca²⁺浓度的增高有关[8], 而慢性低钙血症及维生素D缺乏症时, 肝细胞内Ca2+浓度明显低于正常[9]; 铜缺乏症时, 血小板内Ca2+浓度降低等[10].

Ca²⁺作为重要的胞内信号转导枢纽与壁细胞酸分泌功能的关系也已明确. 胃泌素、组胺和乙酰胆碱等酸分泌刺激因子作为第一信使作用于壁细胞表面的各自受体均可引起胞内[Ca²⁺]i的升高, 从而激活各种Ca²⁺/Calmodulin(钙调素)依赖性的蛋白激酶而最后引起H⁺/K⁺-ATPase(氢钾泵)的活化产生泌酸反应[11-12]. 有人用Ca²⁺通道阻滞剂抑制胞内[Ca²⁺]i的升高, 结果发现五肽胃泌素刺激的酸分泌明显减少[13-14], 也有人将大鼠胚胎干细胞胃泌素受体的基因敲除, 结果壁细胞胞内[Ca²⁺]i增高了, 基础和负荷(Carbacol或组织胺刺激)后的酸分泌亦有所增加[15], 可见Ca²⁺作为胞内重要的信使与壁细胞泌酸的生理功能关系密切.

脾虚是以消化系统为主的多系统、多器官功能低下的一种病理状态, 我们的研究表明脾虚大鼠壁细胞静息状态下胞内[Ca²⁺]i明显低于正常大鼠(P<0.05), 但胃泌素刺激后胞内[Ca²⁺]i的增高幅度显著高于正常大鼠(P<0.01), 各治疗组中, 静息状态下胞内[Ca²⁺]i及胃泌素刺激后的胞内[Ca²⁺]i的增高幅度介于二者之间, 这与我室前期整体研究结果基本一致, 表明血清药理学方法应用于壁细胞的体外研究是可行的. 该方法克服了整体实验操作复杂、用药时间长等缺点, 同时又避免了直接加药非药物因素影响多等缺点, 而且组内及组间易于保持平衡而导致样本间的离散度(标准差)较小阳性结果易于检出.

脾虚大鼠壁细胞静息状态下胞内[Ca²⁺]i明显低于正常大鼠, 说明脾虚大鼠壁细胞基础状态下在Ca²⁺-泌酸环节上可能处于低能量代谢状态; 胃泌素是一重要的酸分泌刺激因子[16], 脾虚大鼠壁细胞胃泌素刺激后胞内[Ca²⁺]i增高幅度大于正常大鼠, 又表明脾虚大鼠壁细胞反应敏感性高于正常大鼠, 提示脾虚大鼠壁细胞胃泌素刺激的酸分泌通路在Ca²⁺这一环节上可能出现了代偿, 这又与我们前期实验得出的"脾虚大鼠壁细胞基础状态酸分泌低下, 受刺激后亢进"的结论相一致, 其机制是否与壁细胞上的胃泌素受体亲和力增高(我室前期研究结果)相关尚有待进一步深入探讨. 脾虚经含药血清作用后的各组中, 静息状态下[Ca²⁺]i均有所升高, 胃泌素刺激后的胞内[Ca²⁺]i增高幅度也有一定程度的降低, 其中党参治疗组胃泌素刺激后的胞内[Ca²⁺]i增高幅度与模型组相比差异显著, 说明大鼠的脾虚状态经补脾方药作用后随着便溏、弓背、消瘦、背毛蓬松等整体状态恢复的同时微观病理指标亦有不同程度的恢复趋势.

总之, 本实验采用血清药理学方法从中医方证角度对脾虚状态微观病理机制进行了初步探讨, 表明: (1)脾虚大鼠壁细胞静息下胞内[Ca²⁺]i及刺激后[Ca²⁺]i的异常变化可能是脾虚证在分子水平上的病理机制之一, Ca²⁺的异常介导可能参与了脾虚证的病理形成过程; (2)补脾方药血清可从整体和微观不同程度调整脾虚大鼠的病理状态; (3)脾虚状态不仅仅表现为一种外在的整体的抽象概念, 也与某些特定微观病理指标相联系.

备注

编辑:张海宁

参考文献

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