临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-10-28; 13(20): 2450-2454
在线出版日期: 2005-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i20.2450
原发性胆汁性肝硬化与自身免疫性胆管炎的临床特征和HLA-DRBl等位基因分析
陈嵩, 朱刚剑, 邓国宏, 朱妍
陈嵩, 邓国宏, 朱妍, 第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
朱刚剑, 荆州市第二人民医院感染科 湖北省荆州市 434000
陈嵩, 男, 1963-09-22生, 贵阳市人, 汉族, 博士, 现为第三军医大学西南医院全军感染病研究所主任医师、副教授, 主要从事慢性肝炎的基础与临床研究.
通讯作者: 陈嵩, 400038, 重庆市, 第三军医大学西南医院全军感染病研究所. cs196@medmail.com.cn
电话: 023-68754475
收稿日期: 2005-08-29
修回日期: 2005-09-01
接受日期: 2005-09-06
在线出版日期: 2005-10-28

目的: 分析原发性胆汁性肝硬化(PBC)和自身免疫性胆管炎(AIC)患者的临床表现、肝组织病理学特征及其与HLA-DRB1等位基因的相关性.

方法: 回顾性分析PBC患者94例, 筛选出13例AIC、9例PBC和自身免疫性肝炎(AIH)重叠综合征(PBC/AIH重叠综合征), 分析AIC、PBC/AIH重叠综合征和单纯PBC患者的临床表现和肝组织病理学特征, 采用序列特异性多聚酶链反应(PCR-SSP)进行HLA-DRB1等位基因分析.

结果: AIC和单纯PBC比较, 在年龄、性别、血生化及肝组织病理学上不能区分二者, 但是AIC患者治疗前AIH计分(8.8±0.9 vs 4.6±0.8, t = 17.45, P<0.01）、ANA和/或SMA阳性率(84.6% vs 22.2%, χ2 = 17.003 9, P<0.01)明显高于单纯PBC. AIC患者血清ALT、AST、IgG明显低于PBC/AIH重叠综合征患者. PBC患者的HLA-DRBl*08基因频率比健康对照组的显著增高(9.7% vs 3.3%, RR = 4.42, P<0.05), 而比AIC患者有增高的趋势.

结论: AIC可能仅是PBC的一种变异形式, 中国汉族PBC的发病与HLA-DR8相关.

关键词: 肝硬化; 胆汁性; 肝炎; 自身免疫性; 胆管炎; 重叠综合征
引文著录: 陈嵩, 朱刚剑, 邓国宏, 朱妍. 原发性胆汁性肝硬化与自身免疫性胆管炎的临床特征和HLA-DRBl等位基因分析. 世界华人消化杂志 2005; 13(20): 2450-2454
Clinical pathology and HLA-DRB1 allele associations of primary biliary cirrhosis and autoimmune cholangitis in Han Chinese
Song Chen, Gang-Jian Zhu, Guo-Hong Deng, Yan Zhu
Song Chen, Guo-Hong Deng, Yan Zhu, Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Gang-Jian Zhu, Institute of Infectious Diseases, the Second Hospital of Jingzhou City, Jingzhou 434000, Hubei Province, China
Correspondence to: Song Chen, Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. cs196@medmail.com.cn
Received: August 29, 2005
Revised: September 1, 2005
Accepted: September 6, 2005
Published online: October 28, 2005

AIM: To analyze the clinical and pathological characte-ristics of both primary biliary cirrhosis (PBC) and auto- immune cholangitis (AIC), and to explore their associ-ations with HLA-DRB1 alleles in Han Chinese.

METHODS: Of 94 patients diagnosed with PBC, 12 cases of AIC and 9 cases of overlap syndrome of PBC and au-toimmune hepatitis (AIH) were identified. The clinical manifestations and pathological changes exhibited in the liver biopsies from AIC, pure PBC and overlap syndrome were comparatively analyzed. The frequencies of HLA-DRB1 alleles were determined in AIC and PBC patients and healthy controls by polymerase chain reaction with sequence specific primers.

RESULTS: The age, sex, clinical manifestations, bio-chemical markers and histological findings were not significantly different between the AIC and pure PBC patients. However, the score for AIH and the positive rate of serum antinuclear antibody and/or smooth muscle antibody were higher in patients (8.8±0.9 vs 4.6±0.8, t = 17.45, P <0.01; 84.6% vs 22.2%, χ2 = 17.003 9, P <0.01). The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST) and immunoglobulin G in AIC patients were markedly lower than those in the overlap syndrome patients (t = 3.44, P <0.01; t = 2.83, P <0.01; t = 2.18, P <0.05). Higher allele frequency of HLA-DRB1*08 was found in pure PBC patients, versus controls (9.7% vs 3.3%, RR = 4.42, P <0.05), and the allele frequency of HLA-DRB1*08 tended to increase in pure PBC patients.

CONCLUSION: Except the pretreatment score for AIH and the types of immunoserological marker, there were no differences between AIC and pure PBC. AIC may only be a variant pattern of PBC, rather than a separate disease.

Key Words: Liver cirrhosis; Biliary; Hepatitis; Autoimmune; Cholangitis; Overlap syndrome
0 引言

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种慢性肝内胆汁淤积性疾病, 在病理学本质上表现为进行性非化脓性胆管炎, 血清抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody, AMA)是其标志性抗体[1-3]. 在北欧和北美白种人群中, 很多研究显示血清学鉴定的HLA-DR8抗原是PBC易感性的主要决定簇, 相应的易感等位基因是HLA-DPBl*0301和HLA-DQβ1*0402[4,5]. 来自丹麦的PBC患者具有不同于德国和北美的易感等位基因, 但主要集中于HLA-DQA1*l0501 DQB1*10201[6]. 约5-8%的PBC患者检测AMA阴性, 而常伴有抗核抗体(anti-nuclear antibody, ANA)和/或抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibody, SMA)阳性. 其在临床表现、血生化和肝脏组织病理学上很难与AMA阳性PBC相区别, 被称为自身免疫性胆管炎(autoimmune cholangitis, AIC)[7-10]. 欧美的AMA阴性PBC患者没有显示易感的HLA-DRBl和HLA-DQBl等位基因[11]. 我们对94例临床诊断为PBC的患者进行回顾性研究, 发现AIC 13例、PBC和自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)重叠综合征(PBC/AIH重叠综合征)9例, 对AIC、PBC/AIH重叠综合征及单纯PBC患者的临床表现和肝组织病理学特征进行比较, 并采用序列特异性PCR扩增法(PCR-SSP)对AMA阳性和AMA阴性PBC患者的HLA-DRBl等位基因进行分析, 以探讨中国汉族PBC与AIC的临床表现、肝组织病理学及遗传背景差异.

1 材料和方法
1.1 材料

西南医院和荆州市第二人民医院1993-01/2005-01确诊PBC的住院患者94例, 平均年龄51.9±7.2岁, 病程3.4±2.2 a, 诊断均符合美国肝病学会2000年发表的诊断指南[12]. AIC的诊断标准引自Czaja et al[13]提出的标准: (1)ANA和/或SMA阳性和/或高丙种球蛋白血症; (2)具有胆汁淤积和肝细胞损伤的生物化学和(或)组织学特点; (3)免疫荧光法检测AMA阴性; (4)除外慢性病毒感染、代谢性或中毒性肝病. 同时, 参照1998年国际自身免疫性肝炎小组修订的描述性诊断标准和计分系统[14], 对AMA阳性的PBC患者临床治疗前进行评分, 从中筛选具有AIH特征的PBC患者, 临床诊断PBC/AIH重叠综合征. 药物治疗后症状消失、血清胆红素恢复正常、ALT≤正常值的2倍、ALP≤治疗前水平的50%为有效, 否则为无效. DL1300-1601-3G(肝抗原谱)试剂盒购自欧蒙公司, 试剂号分别FAl300-1005-2(肝脏马赛克2, ANA、SMA、AMA、抗-LKMl)和FAl201-1005-1(粒细胞马赛克1). 肝脏马赛克2选择HEP-2细胞和5种组织(猴肝脏和心肌组织, 大鼠肝、肾和胃组织)的冰冻切片作为抗原.

1.2 方法

间接免疫荧光法检测血清中ANA、SMA、AMA、抗-LKMl、ANCA, 采用生物薄片马赛克技术(biochipmosa)将带有细胞和组织的6种切片组合成一个反应区. 4℃保存备用. 待检血清1∶100起稀释, 与组织细胞孵育30 min; 加入硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体结合30 min; 洗片、封片后荧光显微镜观察结果. 组织或细胞内出现特异性绿色荧光、血清稀释度>1∶100为阳性. 粒细胞马赛克1操作过程与上述基本相同, 血清稀释度1∶10为阳性检测. 免疫印迹法检测AMA-M2, 抗-LKMl, 抗-LC1, 抗-SLA/LP: 将包被有AMA-M2, LKM1, LC1, SLA/LP抗原的包被膜条置于样品缓冲液中于摇床上预处理5 min, 弃液体; 将待检血清1∶101稀释, 与膜在水平振荡条件下温育30 min; 充分洗膜后加入酶标记抗人IgG孵育30 min; 充分洗膜后以NBT/BCIP显色、去离子水终止反应. 用欧蒙公司提供的标准条带图比较, 判定结果. PCR-SSP法进行HLA-DRB1分型: 每个PCR反应体系中包括2-4等位基因或组特异性引物, 内参照引物的浓度为1/5. PCR混合液(13 μL)由基因组DNA(100 ng)、PCR缓冲液(50 mmol/L KCl+1.5 mmol/L MgC12+10 mmol/L Tris-C1, pH 8.3, 10 mg/L明胶)、200 μmol/L的dNTP, 1 μmol/L DRB1等位基因引物、0.2 μmol/L AmpliTaq酶(以1×PCR缓冲液1∶10稀释, 加拿大生物工程公司上海分公司). PCR扩增在GeneAmp PCR System 9600(Perkin-E1mer Cetus Instruments)中进行. DNA被扩增30个循环. 每一循环由94℃ 20 s、65℃ 50 s和72℃ 20 s组成. PCR产物的存在与否由琼脂糖凝胶电泳鉴定. 加载样液(300 mL/L甘油, 加溴酚蓝和二甲苯青染色)2.5 μL后, PCR反应混合物加至以溴乙锭染色(0.5 mg/L)的10 g/L琼脂糖凝胶中的加样孔中, 以7-8 V/cm的电压电泳25-30 min. 在紫外线下显色, 并摄影记录. ELISA方法检测全部血清的病毒性肝炎指标(抗-HAV IgM, HBsAg, 抗-HBs, HBeAg, 抗-HBe, 抗-HBc, 抗-HCV IgM和IgG, 抗-HEV IgM和IgG等). B超引导下行肝活检术, 活检标本分别用40 g/L甲醛固定, 石蜡包埋, 切片做HE染色, 光镜检查. 根据Ishak et al[15]提出的标准进行肝组织炎症分级计分和纤维化分期计分, 并结合临床根据AIH计分系统进行肝脏组织病理学及治疗前AIH计分.

统计学处理 采用SPSS 10.0软件包进行统计学处理, 计量资料用方差分析, 计数资料用卡方检验. HLA-DRB1各基因亚型采用直接计数法. HLA-DRB1基因频率 = 阳性基因数/样本数×2. 各组间HLA-DRB1基因频率的比较采用χ2检验或Yate校正法. 相对危险度(RR)按Woolf公式计算.

2 结果

在PBC患者94例中, 血清AMA阴性13例, 均符合AIC诊断标准, 男1例, 女12例, 平均年龄51.9±7.2岁; PBC/AIH重叠综合征患者9例, 平均年龄48.1±6.1岁, 男1例, 女8例. 与单纯PBC患者比较, AIC患者年龄、性别、病程、临床症状、伴发其它自身免疫性疾病比例的差异均无统计学意义. AIC与PBC/AIH重叠综合征患者血清ALT、AST、IgG比较, 差异均有统计学意义(t值分别为3.44, 2.83, 2.18; P值分别为<0.01, <0.01, <0.05). AIC患者和单纯PBC患者在GGT, ALP, ALT, AST, IgG, IgM等方面差异无统计学意义. AIC患者血清ANA和/或SMA阳性11例(84.6％), 单纯PBC患者11例(22.2％), 两者间有显著差异(χ2 = 17.003 9, P<0.01, 表1). 治疗前AIH计分AIC患者为8.8±0.9, 单纯PBC患者4.6±0.8, PBC/AIH重叠综合征为11.2±0.6, AIC患者高于单纯PBC患者(t = 17.45, P<0.01), 低于PBC/AIH重叠综合征患者(t = 6.93, P<0.01), 差异有统计学意义. AIC患者有2例治疗前AIH计分≥10分, AMA阳性的PBC患者有9例, 两者间无显著差异(χ2 = 0.026 8, P>0.05).

表1 AIC 、PBC/AIH重叠综合征和单纯PBC患者的实验室检查比较 (mean±SD).
分组nALT (nkat/L)AST (nkat/L)GGT (nkat/L)ALP (nkat/L)lgG (g/L)lgM (g/L)
PBC/AIH93 829.1±1 878.7b3 434.0±1 440.3b8 853.4±2 447.28 031.6±3 042.322.3±3.7b5.3±1.0
AIC131 808.7±695.11 825.4±996.98 466.7±2 945.68 665.1±2 680.517.8±3.14.7±1.0
单纯PBC721 892.0±831.81 942.1±873.58 890.1±4 275.99 176.8±3 902.417.5±2.54.8±1.3
bP<0.01 vs 单纯PBC和AIC.
2.1 肝组织病理学

AIC患者在肝组织炎症分级计分、肝组织AIH计分等指标方面, 均明显低于PBC/AIH重叠综合征患者; AIC和单纯PBC比较, 在肝组织炎症分级计分、纤维化分期计分及肝组织AIH计分的差异无统计学意义(表2).

表2 AIC 、PBC/AIH重叠综合征和单纯PBC患者病理分级分期及AIH计分比较 (mean±SD).
分组n炎症分级纤维化分期肝脏组织学AIH计分
PBC/AIH96.3±1.4b3.1±0.8b0.6±0.7b
AIC133.2±1.3d2.3±0.9c-0.8±0.9d
单纯PBC723.0±1.62.2±0.9-1.1±0.9
bP<0.01 vs 单纯PBC;
cP<0.05,
dP<0.01 vs PBC/AIH重叠综合征.
2.2 HLA-DRBl分型

以PCR-SSP进行的HLA-DRBl分型表明, DRBl*08(编码HLA-DR8抗原)的基因频率在PBC患者组(9.7%)较健康对照组(3.3%)显著增高(P<0.05, RR = 4.42), 未见其他等位基因与PBC有显著相关性; PBC患者中的DRBl*08较AIC患者中有增加的趋势(表3).

表3 单纯PBC、AIC和正常人群HLA-DRB1等位基因的分布.
分组被检染色体数HLA-DRB1等位基因的阳性数
01030407080910111213141516
PBC1741721363022a12101133122
AIC263344010112031
正常对照1201213221641292113152
aP = 0.03, χ2= 4.42 vs 正常对照.
2.3 随访及治疗反应

AIC患者中11例采用熊去氧胆酸治疗, 250 mg, 3次/d, 1年后有效7例(63.7%); 单纯PBC患者72例中, 13例失访, 其余59例患者均采用熊去氧胆酸治疗, 250 mg, 3次/d, 1年后有效45例(76.3%), 两组间治疗效果无明显差异(χ2 = 0.254 6, P>0.05). 随访过程中, AIC患者有1例由ANA阳性在随访10 mo转变为AMA及ANA阳性. 单纯PBC患者有3例在随访第3, 12, 23 mo AMA转阴, 其中2例仍可查出ANA和/或SMA.

3 讨论

我们从94例PBC患者中筛选出AIC13例(13.8%)、PBC/AIH重叠综合征9例(9.6%), 未发现PBC与PSC的重叠病例. PBC患者的AMA阳性率为86.2%, 低于文献报道. AIC是PBC或AIH的亚型, 还是两者的重叠或独立的疾病众说纷纭[16-19]. Lacerda et al[20]从597例临床和病理诊断为PBC的患者中分出35例AMA阴性患者和AMA阳性患者两组比较, 无论从临床、生化或病理上都不能区分二者, 故认为AIC是PBC的一个亚型. Czaja et al[21]对162例临床诊断为Ⅰ型自身免疫性肝炎的患者采用AIH计分标准, 发现11例符合AIC的临床和病理特点, 说明AIC可同时具有PBC和AIH的临床特征, 表现为二者的重叠. 我们从年龄、性别、血生化及肝组织病理学特征上不能区分AIC和单纯PBC, 但AIC患者治疗前AIH计分、ANA和/或SMA阳性率明显高于单纯PBC; 对AIC与PBC/AIH重叠综合征进行比较, AIC血清ALT、AST、IgG水平明显低于PBC/AIH重叠综合征. 这提示AIC可能是PBC/AIH重叠综合征的边缘阶段. AMA阳性与AMA阴性的PBC患者胆管上皮表达丙酮酸盐脱氢酶复合物(M2抗原)的相似性支持AIC与PBC的相互关系[13,20-22]. 从治疗方法上看, 采用UDCA治疗大部分AIC病例有效, 与皮质类固醇治疗AIH不同[23]. 这些特点说明自身免疫性胆管炎比AIH更近似于PBC.

人类白细胞抗原(HLA)是研究得最多的人类免疫遗传学系统, 在自我识别、免疫调节和对异体移植物的排斥反应等过程中发挥重要作用[24-26]. 现已发现70多种疾病与HLA的多态性有关, 其中大多数自身免疫性疾病与Ⅱ型HLA基因相关[27]. 采用PCR-SSP法对HLA-DRBl进行分析, 我们发现DRBl*08(编码DR8)基因频率在PBC患者为9.7%, 而在健康对照组为3.3%, 有显著性差异(P<0.05, RR = 4.42), 提示DR8相应的等位基因是中国汉族PBC的危险因素. 这与来自白种人群的研究结果较为相似. 在中国汉族人群中, 仍有约85%PBC患者与HLA-DR8相应的等位基因无关联. 在白种人群中, PBC关联的HLA-DRB1*0801、HLA-DQBl*0402单倍型存在连锁不平衡[28,29]. 这提示推测的PBC易感等位基因可能仅是Ⅱ型MHC区域中的一种, 而不是HLA分子本身. 采用短串联重复方法将有助确定PBC关联基因的精确位置. HLA基因和/或其他关联基因在PBC发病过程中可能单独或者与其他遗传性状及环境因素协同发挥作用. 我们发现, 13例AIC患者缺乏AMA阳性PBC患者相关的HLA-DRBl*08等位基因. 这可能反映所选用的AIC病例数太少; 也可能从遗传背景看, AIC是一种独立的自身免疫性疾病. 然而, 除了治疗前AIH计分及自身抗体的类型不同外, AIC和单纯PBC在临床表现、肝组织病理和治疗特征上的差异无统计学意义. 因此, 我们认为AIC可能是AMA阳性PBC的一种变异形式, 而非另一种不同的疾病. 至于相关的HLA-DR8可能只是PBC的一种表现形式, 而非其发病的遗传易感因素.

电编: 张敏 编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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