修回日期: 2004-09-07
接受日期: 2004-09-30
在线出版日期: 2005-01-15
目的: 利用基因表达谱芯片技术筛选、比较丙型肝炎病毒NS5A反式调节基因2不同剪切体对HepG2细胞基因表达的调控作用及差异性.
方法: 利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合, 克隆人NS5ATP2的不同剪切体蛋白的编码基因, 常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1-NS5ATP2(216). 脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2. 利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型.
结果: 对于2个基因剪切体转染细胞系差异表达基因谱的分析, NS5ATP2(615)和NS5ATP2(216)共同上调的基因43条; NS5ATP2(615)和NS5ATP2(216)共同下调的基因13条; NS5ATP2(615)上调, 而NS5ATP2(216)下调的基因类型3条; 未发现NS5ATP2(615)下调; NS5ATP2(216)上调的基因类型; 还有一些靶基因, 或只受到NS5ATP2(615)的调节, 或只受到NS5ATP2(216)的调节.
结论: 不同剪切体的作用之间有共同的靶基因, 也有不同的靶基因, 甚至对于同一基因有相反的调节功能.
引文著录: 成军, 杨倩, 刘妍, 王建军, 纪冬. 丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式调节基因2不同剪切体调节靶基因的比较. 世界华人消化杂志 2005; 13(2): 198-201
Revised: September 7, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: January 15, 2005
AIM: To identify and analyze target genes regulated by different spliced transcripts of human NS5ATP2 by microarray technique.
METHODS: The coding sequences for the two differently spliced transcripts of human NS5ATP2, NS5ATP2 (615) and NS5ATP2, were cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 to yield pcDNA3.1-NS5ATP2 (615) and pcDNA3.1-NS5ATP2 (216) constructs, which were then transfected into HepG2 cells. The differentially expressed genes in the cells transfected with the two differently spliced variants were analyzed and compared by DNA microarray.
RESULTS: Forty-three genes were up-regulated by both NS5ATP2 (615) and NS5ATP2 (216), and 13 genes were down-regulated by both NS5ATP2 (615) and NS5ATP2 (216). Meanwhile, 3 genes were found to be up-regulated by NS5ATP2 (615), but down-regulated by NS5ATP2 (216). No genes were down-regulated by NS5ATP2 (615) while up-regulated by NS5ATP2 (216). Many genes were trans-regulated by NS5ATP2 (615) or NS5ATP2 (216) independently.
CONCLUSION: Different spliced transcripts of human NS5ATP2 may commonly or independently regulate target genes. They even exhibit opposite regulatory effects upon some target genes.
- Citation: Cheng J, Yang Q, Liu Y, Wang JJ, Ji D. Comparison of target genes transactivated by different spliced transcripts of human NS5ATP2. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(2): 198-201
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i2/198.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i2.198
丙型肝炎病毒(HCV)感染后表达的病毒结构和非结构蛋白抗原, 对于肝细胞的基因表达谱产生重要影响, 这种异常的调节是慢性丙型肝炎、肝纤维化、肝细胞癌发生、发展的重要的分子生物学机制[1]. HCV结构和非结构蛋白通过直接或间接的机制, 对于肝细胞的基因表达调控产生影响, 造成肝细胞基因表达谱发生改变[2]. 我们发现HCV结构和非结构蛋白具有广泛的反式调节作用[3]. 其中包括一种未知功能基因, 命名为NS5ATP2. 在NS5ATP2的cDNA克隆化的聚合酶链反应(PCR)扩增中, 发现了NS5ATP2基因长度为615 nt和216 nt的不同剪切型[4]. 为了研究NS5ATP2基因及其不同的剪切型在肝细胞中的生物学功能及其差别, 我们利用基因表达谱芯片技术对于NS5ATP2基因不同剪切型NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)的反式调节的靶基因进行了比较分析.
NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)真核表达载体的构建. 将NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)的cDNA片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 进行限制性片段长度多态性和序列测定. 肝母细胞瘤细胞系HepaG2细胞系的转染利用脂质体转染试剂进行转染[4].
NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)基因表达产物反式激活靶基因的基因芯片技术筛选, 利用联合基因公司开发的基因表达谱芯片技术进行筛选, 此基因芯片含有1152点, 包括免疫调节、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等方面的功能基因类型. NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)基因表达产物反式激活靶基因的比较 将NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)基因表达产物共同上调、共同下调、作用相反、没有重叠的靶基因类型进行分析.
NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)共同上调的基因类型包括42条(表1).
| 基因类型 | NS5ATP2(615) | NS5ATP2(216) |
| 1 结肠直肠癌突变基因 | 3.356 | 2.005 |
| 2 butyrophilin | 3.415 | 2.009 |
| 3 MEMD蛋白 | 3.057 | 2.035 |
| 4 甘氨酰转移酶 | 4.157 | 2.041 |
| 5 SIAH1同源基因 | 4.481 | 2.059 |
| 6 TRAIL受体2 | 2.789 | 2.075 |
| 7 真核翻译起始因子4A | 2.164 | 2.086 |
| 8 焦磷酸酶 | 4.002 | 2.110 |
| 9 BCRA2新基因 | 4.422 | 2.114 |
| 10 细胞凋亡相关RNA结合蛋白 | 2.393 | 2.122 |
| 11 SMAP-3 | 3.435 | 2.126 |
| 12 FLJ31098 | 2.242 | 2.128 |
| 13 LIV-1蛋白 | 3.357 | 2.158 |
| 14 MTHFD2 | 2.409 | 2.160 |
| 15 人cDNA | 3.082 | 2.188 |
| 16 L型电压依赖型钙通道a1亚单位 | 2.960 | 2.197 |
| 17 DnaJ样热休克蛋白40 | 2.800 | 2.202 |
| 18 细胞分化相关ATP结合蛋白 | 2.881 | 2.234 |
| 19 烷化修复蛋白 | 2.603 | 2.255 |
| 20 CDC23 | 2.876 | 2.257 |
| 21 Paraoxonase 2 | 3.609 | 2.355 |
| 22 TGFβIIRα | 3.580 | 2.359 |
| 23 RB蛋白结合蛋白 | 2.728 | 2.398 |
| 24 KIAA0009新基因 | 3.228 | 2.440 |
| 25 PRKAR1A | 3.097 | 2.443 |
| 26 butyrophilin 3A2 | 3.851 | 2.472 |
| 27 锌指蛋白217 | 3.824 | 2.480 |
| 28 肌管蛋白相关蛋白6 | 4.839 | 2.504 |
| 29 固醇C5 desaturase | 4.463 | 2.517 |
| 30 DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位 | 4.209 | 2.564 |
| 31 滑膜肉瘤转位蛋白 | 4.468 | 2.599 |
| 32 cAMP应答元件结合蛋白 | 3.175 | 2.604 |
| 33 G蛋白调节信号调节因子5 | 3.841 | 2.615 |
| 34 CD24抗原 | 2.760 | 2.630 |
| 35 亨廷顿作用蛋白2 | 2.741 | 2.642 |
| 36 泛素特异性蛋白酶1 | 4.205 | 2.648 |
| 37 维生素A应答蛋白 | 2.943 | 2.856 |
| 38 Spualene epoxidase | 4.297 | 3.081 |
| 39 FAP48 | 5.605 | 3.104 |
| 40 PROML1 | 3.221 | 3.343 |
| 41 PRKAR2B | 5.635 | 3.859 |
| 42 胶质瘤放大序列-41(GAS41) | 2.820 | 4.074 |
NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)共同下调的基因类型13条(表2).
| 基因类型 | NS5ATP2(615) | NS5ATP2(216) |
| 1 微染色体维持缺陷3(MCM3) | 0.385 | 0.299 |
| 2 硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1) | 0.341 | 0.326 |
| 3 谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1) | 0.394 | 0.349 |
| 4 Prosaposin(PSAP) | 0.320 | 0.350 |
| 5 肝细胞生长因子激活剂 | 0.382 | 0.381 |
| 6 线粒体内膜17同源基因B转移酶(TIM17B) | 0.481 | 0.413 |
| 7 谷胱甘肽S-转移酶M3 | 0.250 | 0.419 |
| 8 精氨酰琥珀酸合成酶 | 0.309 | 0.452 |
| 9 KIAA0968新基因 | 0.251 | 0.459 |
| 10 MAP激酶激活死亡域(MADD) | 0.456 | 0.464 |
| 11 蛋白磷酸酶1 | 0.421 | 0.472 |
| 12 胰岛素受体 | 0.339 | 0.481 |
| 13 TGFβ1 | 0.327 | 0.497 |
| 基因类型 | NS5ATP2(615) | NS5ATP2(216) |
| 1 MAX作用蛋白1(MXI1) | 2.129 | 0.346 |
| 2 Cofilin异构体1 | 3.935 | 0.477 |
| 3 RAD52 | 4.079 | 0.484 |
未发现NS5ATP2(615)下调, NS5ATP2(216)上调的共同的靶基因类型.
包括乙酰辅酶A氧化酶1相似基因、热休克蛋白70蛋白9B、层黏连蛋白β2、金属蛋白酶组织抑制因子1、大肠杆菌mutS同源基因6、富含半胱氨酸血管形成诱导剂61、肿瘤转移抑制基因1(TSSC1)、烯醇化酶3、组织相容性13、抗氧化蛋白1、Ewing肉瘤断裂点区1、肌醇1, 3, 4三磷酸盐5/6激酶、丝裂原激活蛋白激酶12、1, 25-二羟基维生素D-3上调基因、核糖体蛋白L32、核糖体蛋白L26假基因1、妊娠特异性β-1糖蛋白6、FLJ32313新基因、hnRNA甲基转移酶、ATP合酶、膜金属内肽酶、MGC:10736新基因、NF-κB1A、C12ORF2新基因、核自身抗原精蛋白、PRKACB、泛素激活酶E1样基因、癌高表达基因、核受体亚家族3、减数分裂后分离增加基因1等多种类型的基因.
任何种类人的体细胞中的遗传物质都是23对、46条染色体. 由30亿碱基对组成的序列, 包含了人的全部的遗传信息. 那么为什么会产生不同的细胞? 因为每一种活的细胞中所表达的基因类型、基因表达水平、表达的时空特点都是不一样的[5]. 之所以细胞种类不同, 主要该细胞所表达的基因类型、表达水平、表达组织和细胞特异性、表达的先后顺序等都是不同的. 真核细胞的基因表达调控机制十分复杂, 是在多个水平上进行调节的. 其中最重要的是在转录水平的调节. 转录水平的调节主要包括顺式(cis)和反式(trans)调节两种. 所谓顺式调节就是指分子内部(intra-molecule)的调节, 所谓的反式调节就是指分子之间(inter-molecule)的调节[6]. 最为典型的顺式调节就是启动子启动编码基因的转录过程的调节. 基因组DNA中增强子(enhancer)对于启动子转录活性的调节也属于这一大类. 反式调节则更为广泛, 如转录因子蛋白对于启动子DNA序列的识别和转录活性的调节都属于此类. 但是, 反式调节作用的因子, 不仅仅是蛋白质, 一些RNA分子也具有反式调节作用. 由于反式作用属于分子之间的相互调节, 因而范围更宽. 从广义上来讲, 所有肝炎病毒基因组所编码的病毒蛋白, 都会通过直接或间接途径, 对于肝细胞的基因表达谱产生影响, 因此属于广义上的反式调节因子[7]. HCV的非结构蛋白NS5A是一种作用较强的反式激活作用蛋白. 我们在证实NS5A蛋白具有肯定的反式激活作用的同时, 对于NS5A蛋白反式激活作用靶基因, 利用基因表达谱芯片技术和抑制性消减杂交技术, 对NS5A蛋白反式调节的靶基因进行了系统的研究, 发现NS5A蛋白反式调节的一系列的靶基因. 其中也包含着一种未知功能基因, 命名为NS5ATP2. 为了研究NS5ATP2的生物学功能以及NS5ATP2在慢性丙型病毒性肝炎发病机制中的作用和地位, 我们依据生物信息学分析的结果, 设计合成NS5ATP2基因序列特异性的引物, 利用聚合酶链反应技术对NS5ATP2的编码基因进行扩增. 在基因扩增中意外地发现了NS5ATP2基因存在着不同的剪切型, 从而为研究NS5ATP2的结构和功能、表达与调控、生物学意义以及在慢性丙型肝炎发病中的作用和地位, 增添了新的内容[8].
来源于同一个基因的剪切体有时具有相反的生物学功能, 这在细胞凋亡相关基因的研究中十分常见, 这就是机体通过一定数量的基因表达调控, 实现不同的基因表达调节目的的重要的途径和方式[9]. 为了研究NS5ATP2基因不同剪切型NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)的反式调节的靶基因的差别, 我们利用基因芯片技术分别对于NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)反式调节的肝细胞的靶基因类型进行分析, 然后对于不同剪切型NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)的反式调节的靶基因进行比较分析, 研究不同剪切型NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)的生物学功能的差别[10]. 从本文的研究结果来看, 既有共同上调的靶基因类型, 也有共同下调的靶基因类型. 说明NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)不同剪切型的生物学功能具有相同或相似的一面. 但是, 在比较中也发现NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)反式调节作用的一些差别. 例如, MAX作用蛋白1(MXI1)、cofilin异构体1、RAD52等3种基因受到NS5ATP2(615)基因的上调, 但同时受到NS5ATP2(216)基因的下调. 没有发现受NS5ATP2(615)下调, 而受NS5ATP2(216)上调的基因类型. 当然, NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)分别具有反式调节作用的靶基因类型就更多了, 这反映了NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)基因的反式调节作用的差异和不同[11]. 目前我们仅仅是利用分子生物学技术对于NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)反式调节基因的类型的异同进行了分析和比较, 但是, 关于其生物学功能特性的改变还需要进行更为细致的研究, 毕竟基因表达不同都会表现在细胞的生物学功能和特性的差别这一方面来. 关于NS5ATP2(615)与NS5ATP2(216)不同剪切体对于肝细胞生物学作用的差别, 正在研究之中.
编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁
| 3. | Li K, Wang L, Cheng J, Lu YY, Zhang LX, Mu JS, Hong Y, Liu Y, Duan HJ, Wang G. Interaction between hepatitis C virus core protein and translin protein--a possible molecular mechanism for hepatocellular carcinoma and lymphoma caused by hepatitis C virus. World J Gastroenterol. 2003;9:300-303. [PubMed] |
| 4. | Yang Q, Cheng J, Liu Y, Hong Y, Wang JJ, Zhang SL. Cloning and identification of NS5ATP2 gene and its spliced variant transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A. World J Gastroenterol. 2004;10:1735-1739. [PubMed] |
| 8. | 王 建军, 杨 倩, 成 军, 刘 妍, 纪 冬, 党 晓燕, 王 春花. 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP6的克隆化研究. 胃肠病学和肝病学杂志. 2003;12:251-253. |
| 9. | 刘 妍, 段 惠娟, 成 军, 王 建军, 陆 荫英, 牟 劲松, 王 琳, 张 玲霞. 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒启动子的研究. 军医进修学院学报. 2003;24:81-83. |