奥曲肽联合汉防己甲素对人胃癌细胞增殖的影响

摘要

目的: 观察奥曲肽、汉防己甲素单独及联合应用对体外培养人胃癌细胞株增殖的影响, 并初步探讨其可能的作用机制.

方法: 以MTT比色法观察奥曲肽(善宁)、汉防己甲素(Tet)单独及联合应用对体外培养人胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45增殖的影响, 并用Fura-2/AM荧光标记法测定了其对胃癌细胞内游离Ca²⁺浓度的影响.

结果: 2.4×10^-5 mol/L、2.4×10^-6 mol/L高浓度奥曲肽、10-160 mmol/L浓度范围的Tet对体外培养人胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45均有显著的抑制作用, 其增殖抑制率(IR)分别为, 对SGC 7901: 40.76%、23.2% 和30.5-70.0%; 对MKN 45: 24.9%、21.7% 和20.4-79.01% (P<0.05或P<0.01); 奥曲肽2.4×10^-6 mol/L、2.4×10^-9 mol/L、2.4×10^-12 mol/L分别与Tet 10 mmol/L联合应用, 可将其对 SGC7901和MKN 45的IR分别由32.8%和27.0%提高至50.5%和60.3%、55.0%和47.7%、67.8%和63.0%(vs Tet组P<0.05 或 P < 0.01). 10 mmol/L Tet作用于SGC 7901和MKN 45, 其细胞内游离Ca²⁺浓度较对照组显著降低(394.2 ±18.4 nmol/L vs 505.0±15.8 nmol/L, 412.1±20.8 nmol/L vs 512.0±16.0 nmol/L, P<0.01); 2.4×10^-6 mol/L奥曲肽亦可显著降低胃癌细胞内的钙离子浓度(SGC 7901 450.8±20.1 nmol/L, P<0.01; MKN45 413.1±10.4 nmol/L, P<0.01). 但奥曲肽联合Tet并不能进一步降低胃癌细胞内钙离子浓度.

结论: Tet对体外培养人胃癌细胞有剂量依赖性的抑制作用, 其机制可能是通过降低细胞内游离Ca²⁺浓度发挥其抗增殖作用. 高浓度奥曲肽的抗增殖作用亦可能与其抗钙作用有关; 各浓度奥曲肽可显著提高小剂量Tet对胃癌细胞的抑制作用, 但与其抗钙作用无关.

关键词: 生长抑素; 汉防己甲素; 奥曲肽; 胃癌细胞; 增殖; 钙离子

Inhibitory effects of tetrandrine combined with octreotide on proliferation of gastric cancer cell lines cultured in vitro

Long Wang, Jin-Shui Zhu, Wei-Xiong Chen, Li Zhu, Wei Da, Xiu-Ling Wang

Long Wang, Jin-Shui Zhu, Wei-Xiong Chen, Li Zhu, Wei Da, Department of Gastroenterology, the Sixth Affiliated Shanghai People's Hospital of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China

Xiu-Ling Wang, Department of Gastroenterology, the Affiliated Shanghai Xinhua Hospital of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092, China

Correspondence to: Dr. Long Wang, Department of Gastro-enterology, the Sixth Affiliated Shanghai People's Hospital of Shanghai Jiaotong University, 600 Yishan Road, Shanghai, 200233, China. wanglonglong@smmail.cn

Received: August 10, 2005
Revised: August 19, 2005
Accepted: August 25, 2005
Published online: October 15, 2005

Abstract

AIM: To observe the inhibitory effects of tetrandrine (Tet), octreotide alone and in combination on the gastric cancer cell lines cultured in vitro, and to explore their possible mechanisms.

METHODS: The human gastric cell lines SGC7901 and MKN45 were cultured in vitro. The influences of Tet, octreotide alone and in combination on both kinds of the cells were observed by MTT spectrophotometry, and their effects on the concentration of cytosolic free Ca²⁺ were measured by Fura-2/AM.

RESULTS: Octreotide at high concentrations such as 2.4×10^-5, 2.4×10^-6mol/L, and Tet at concentrations of 10-160 μmol/L significantly inhibited the proliferation of SGC7901 and MKN45 cells, and the inhibitory rates (IR) were 40.76%, 23.2% and 30.5-70.0% for the former, respectively, and 24.9%, 21.7% and 20.4-79.01% for the latter, respectively (P < 0.05 or P < 0.01). Different concentrations of octreotide (2.4×10^-6, 2.4×10^-9, 2.4×10^-12 mol/L) increased the IR of Tet (10 μmol/L) for SGC7901 and MKN45 cells from 32.8% and 27.0% to 50.5% and 60.3%, 55.0% and 47.7%, 67.8% and 63.0%, respectively (P < 0.05 or P < 0.01). The concentrations of free Ca²⁺ in SGC 7901 and MKN 45 cells were significantly reduced as compared with those in the normal controls (394.2±18.4 nmol/L vs 505.0±15.8 nmol/L, 412.1±20.8 nmol/L vs 512.0±16.0 nmol/L, both P < 0.01), and similar results were found in octreotide (2.4×10^-6 mol/L) group (SGC7901: 450.8±20.1 nmol/L, P < 0.01; MKN45: 413.1±10.4 nmol/L, P < 0.01). However, octreotide combined with Tet could not reduce the concentration of free Ca²⁺ to a lower degree.

CONCLUSION: Tet inhibits the proliferation of gastric cancer cell lines cultured in vitro in a dose-dependent manner, and the reduction of the cytosolic free Ca²⁺ concentration may be involved in its anti-proliferation mechanism. The antiproliferation of octreotide at high concentrations may relate to its anti-calcium effect. Different concentrations of octreotide can enhance the anti-proliferation of Tet at low doses, which may not relate to the reduction of the cytosolic calcium concentration.

Key Words: Somatostatin; Tetrandrine; Octreotide; Gastric cancer cell line; Proliferation; Calcium²⁺

0 引言

目前化疗是中晚期失去手术机会的胃癌患者最主要的治疗手段之一, 但疗效欠佳, 副反应大, 对患者生存期限和生活质量都无显著改善, 故探寻更有益的治疗药物意义重大. 生长抑素是人体内自然产生的一种环十四肽激素, 众多研究显示其对多种恶性肿瘤的生长有抑制作用, 但单独应用疗效有限, 联合细胞毒药物或血管生成抑制剂等其它药物可能是新的研究方向[1]. 汉防己甲素(Tetrandrine, Tet)是从植物粉防己(又名汉防己)的根中提取的生物碱, 有研究提示它对许多恶性肿瘤细胞有抑制或杀伤作用, 且其价格低廉, 药源丰富, 动物实验及临床应用均未见任何副作用, 故其抗肿瘤作用值得进一步研究[2]. 为此, 我们选择作用更强、半衰期更长的生长抑素八肽类似物奥曲肽(Octreotide, 商品名善宁, Sandostatin)和Tet, 观察其对体外培养人胃癌细胞增殖的影响, 并初步探讨其作用机制, 以期为后序的动物实验提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及其培养: 胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45均购于中科院上海细胞生物学研究所. 培养条件: 37 ℃、50 mL/L CO₂ 、950 mL/L空气及饱和湿气培养箱中孵育, 培养液用含100 mL/L灭活小牛血清的RPMI 1640, pH 7.0-7.2.

1.1.2 药物及主要试剂: Tet购于浙江金华制药厂, 奥曲肽(善宁)由瑞士Sandoz药厂惠赠; MTT(四甲基偶氮唑蓝)为Sigma公司产品, 以PBS缓冲液配成5 g/L之溶液, 过滤除菌, 4 ℃避光贮存; DMSO, 上海硫酸厂产品; Fura-2/AM, Sigma公司产品, 用DMSO溶解配成1 g/L之储存液, -20 ℃保存, 使用前用D-Hanks液稀释至0.5 g/L, 终浓度为5 mmol/L.

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法测定细胞增殖率: 根据Mosmann首创的MTT法[3], 略加改进: 选对数生长期胃癌细胞, 以2×10⁷/L之浓度接种, 200 L/孔; 24 h后加入不同浓度的药物, 对照组为无血清培养液; 72 h后加入MTT, 20 L/孔, 培养4-6 h后弃去上清液, 每孔加入200 L DMSO, 震荡、摇匀, 放置10-15 min, 以540 nm, 用自动酶标仪测定吸光值(A₅₄₀), 以下列公式计算细胞增殖抑制率(IR). IR(%)=(对照组A₅₄₀ -实验组A₅₄₀)/对照组A₅₄₀×100%.

1.2.2 Fura-2/AM荧光标记法测定细胞内Ca²⁺浓度[4]: 以2×10⁸/L之浓度接种细胞于6孔培养板, 24 h后加入不同浓度的药物, 24 h后收集单细胞悬液, 避光加入Fura-2/AM, 37 ℃温育50 min, 使其负栽入细胞内; 之后用D-Hanks液洗涤细胞两次以除去细胞外未负栽的Fura-2, 并重悬细胞, 再37 ℃温育15 min, 即可用RF-540型分光光度计测定. 测定条件: Ex 340 nm, Em 510 nm, Ex光栅10nm, Em光栅10 nm. 计算公式: [Ca²⁺]i=Kd.(F-Fmin)/(Fmax-F), F为实测荧光值, Fmax和Fmin分别为加入Triton X-100所测的最大荧光值和加入EGTA所测的最小荧光值, Kd为Fura-2/AM的解离常数, 为224 nmol/L.

统计学处理 实验数据采用SPSS 11.0进行处理分析, 数据以mean±SD表示, P<0.05为有统计学意义.

2 结果

2.1 奥曲肽单独应用对胃癌细胞增殖的影响(表1)

表1 奥曲肽对胃癌细胞株增殖的影响 (n = 6).

奥曲肽(mol/L)	SGC 7901	IR(%)	MKN 45	IR(%)
	A540(mean±SD)		A540(mean±SD)
对照组	0.314±0.054	/	0.469±0.024	/
2.4×10-5	0.186±0.006	40.76b	0.352±0.007	24.9b
2.4×10-6	0.241±0.048	23.2a	0.367±0.022	21.7b
2.4×10-7	0.289±0.019	8.0	0.456±0.022	2.8
2.4×10-8	0.293±0.037	6.7	0.502±0.041	-7.0
2.4×10-9	0.306±0.026	2.5	0.519±0.056	-10.7
2.4×10-10	0.299±0.026	4.8	0.493±0.030	-5.1
2.4×10-11	0.295±0.033	6.1	0.533±0.054	-13.6
2.4×10-12	0.306±0.054	2.5	0.493±0.024	-5.1

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

我们选用2.4×10^-12-2.4×10^-5 mol/L浓度之奥曲肽作用于体外培养人胃癌细胞株, 结果显示2.4×10^-5 mol/L和2.4×10^-6mol/L等高浓度奥曲肽可显著抑制SGC 7901和MKN 45的生长, 其IR分别为40.76%和23.2%, 24.9%和21.7%, 且各组与对照组相比较都有统计学差异. 2.4×10^-12-2.4×10^-7mol/L奥曲肽对人胃癌细胞株的增殖无明显的抑制作用, 在MKN 45组, 有些浓度的IR为负值, 即可轻度刺激癌细胞的增殖, 但均无统计学意义.

2.2 Tet单独应用对胃癌细胞增殖的影响

Tet对体外培养的人胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45均有明显的抑制作用, 且呈剂量依赖性(表2). 在10-160 mmol/L浓度范围, 其对SGC 7901和MKN 45细胞的增殖抑制率(IR)分别为30.5-70.0%, 20.4-79.0%(P<0.01). 实验中可见, 用药组MKN 45细胞变小, 呈透亮的小球状, 而SGC 7901细胞则呈球状或梭形.

表2 Tet对胃癌细胞增殖的影响 (n = 6).

Tet(mol/L)	SGC 7901	IR(%)	MKN 45	IR(%)
	A540(mean±SD)		A540(mean±SD)
对照组	0.367±0.027	/	0.486±0.145	/
160	0.111±0.010	70.00b	0.102±0.049	79.0b
40	0.147±0.009	60.0b	0.113±0.010	76.7b
10	0.255±0.027	30.5b	0.387±0.040	20.4b
4	0.325±0.045	11.4a	0.506±0.082	-4.1
2.5	0.332±0.040	9.5	0.474±0.096	2.5

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

2.3 奥曲肽联合Tet对胃癌细胞增殖的影响(表3)

表3 奥曲肽及Tet联合应用对胃癌细胞株增殖的影响 (n = 6).

组别	SGC 7901	IR(%)	MKN 45	IR(%)
	A540(mean±SD)		A540(mean±SD)
对照组	0.658±0.056	/	0.633±0.082	/
奥曲肽(mol/L)
2.4×10-6	0.497±0.056	24.5b	0.484±0.056	23.5b
2.4×10-9	0.648±0.035	1.5	0.600±0.014	5.21
2.4×10-12	0.700±0.127	-6.4	0.589±0.032	6.95
Tet10 mol/L	0.442±0.038	32.8b	0.462±0.046	27.0b
奥曲肽(mol/L)
2.4×10-6+Tet	0.326±0.054	50.5bc	0.251±0.022	60.3bd
2.4×10-9+Tet	0.296±0.056	55.0bc	0.331±0.055	47.7bc
2.4×10-12+Tet	0.212±0.019	67.8bd	0.234±0.013	63.0bd

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs Tet组.

奥曲肽2.4×10^-6 mol/L、2.4×10^-9 mol/L、2.4×10^-12 mol/L分别与Tet 10 mmol/L联合应用, 可将Tet对 SGC7901和MKN 45的IR分别由32.8%和27.0%提高至50.5%和60.3%、55.0%和47.7%、67.8%和63.0% (vs Tet组 P<0.05或 P<0.01).

2.4 奥曲肽和Tet对胃癌细胞内游离Ca²⁺浓度的影响

奥曲肽2.4×10^-6 mol/L作用于胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45时其细胞内游离Ca²⁺浓度分别为450.8±20.1 nmol/L和413.1±10.4 nmol/L, 分别较其对照组505.0 nmol/L和512.0 nmol/L显著降低. 而 2.4×10^-9 mol/L和2.4×10^-12 mol/L奥曲肽对胃癌细胞内游离Ca²⁺浓度无显著影响. 10 mmol/L的Tet亦可显著降低胃癌细胞内游离Ca²⁺浓度(P<0.01), 与三种浓度奥曲肽联合应用后, 细胞内Ca²⁺浓度较对照组均显著降低, 但与Tet组相比均无统计学差异(表4).

表4 奥曲肽和Tet对胃癌细胞内游离Ca²⁺浓度的影响 (mean±SD, nmol/L, n = 6).

组别	SGC7901	MKN45
对照组	505.0±15.8	512.0±16.0
奥曲肽(mol/L)
2.4×10-6	450.8±20.1a	413.1±10.4b
2.4×10-9	460.8±44.4	480.5±15.4
2.4×10-12	466.5±12.1	473.1±10.4
Tet(10 mol/L)	394.2±18.4b	412.1±20.8b
奥曲肽(mol/L)
2.4×10-6+Tet	370.9±27.8b	386.5±15.3b
2.4×10-9+Tet	400.7±12.6b	423.5±10.3b
2.4×10-12+Tet	383.8±17.5b	396.5±16.4b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

3 讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤, 全世界每年发病率为17.6/10万. 在我国, 胃癌的死亡率高居恶性肿瘤的首位, 发病率在恶性肿瘤中位居第二. 因此进行胃癌治疗的研究有重大的现实价值. 中药Tet是从防己科植物汉防己或粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)和千金藤(Stephania japonic Miers)中分离的一种生物碱, 系双苄基异拉啉类化合物, 具有消炎、解热、镇痛、抗过敏、降血压及抗肿瘤等作用[2,5-7]. 很多研究表明Tet在体外和体内对多种恶性肿瘤的生长有抑制作用, 其中的机制可能涉及: (1)直接抗肿瘤作用: 一方面Tet可能通过抑制DNA和RNA的合成起作用, 另一方面可能通过诱导癌细胞凋亡而发挥其抗瘤活性[8-11]; (2)放疗增敏: 临床和实验研究均显示Tet可明显增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用[12-14]; (3)减毒作用: 低剂量Tet(2 g/L)可以在体外预防单次高剂量照射(10 Gy)对正常人单核细胞的损害, 呈剂量依赖性[15]; Tet还可减轻鼠急性放射性皮炎[6]; (4)逆转肿瘤细胞的多药耐药性: Tet是一种多药耐药调节剂, 其作用可能与P-糖蛋白有关而不一定与其抗钙作用有关[16-18]; 有研究显示无细胞毒作用的Tet可增强阿霉素对抗三尖杉酯碱的HL60细胞的生长抑制作用, 但不增加阿霉素对敏感的HL60细胞的毒性, 其机制除Tet可逆转肿瘤细胞多药耐药(MDR)外还可能与其逆转MCF/Adr细胞的凋亡抗性有关[19,20]. (5)抑制血管形成: Kobayashi et al[21]的研究表明Tet在慢性炎症过程中可以通过IL-1a和PDGF-BB的受体后机制下调血管内皮细胞管腔形成, 具有抗血管生成作用. 目前有关Tet在胃癌中的研究较少, 故本研究用MTT比色法观察了Tet对体外培养的人胃癌细胞株增殖的影响, 结果显示其在10-160 mmol/L浓度范围, 对体外培养的人胃癌细胞株SGC 7901和MKN 45均有显著的抑制作用, 且呈剂量依赖性. 现有的研究已证实Tet是一种中草药来源的钙拮抗剂(calcium antagonist, CaA)[22], 本研究也显示10 mmol/L Tet可明显降低细胞内游离Ca²⁺浓度, 而此浓度Tet对两株胃癌细胞都有一定的抑制作用. Ca²⁺是细胞内重要的第二信使物质, 参与包括增殖等在内的许多细胞功能, 故推断Tet抗增殖作用可能与其降低细胞内游离Ca²⁺浓度有关. Tet的抗钙机制目前还不十分明确, 它可能是通过阻滞细胞膜上电压依赖性钙通道, 减少细胞外Ca²⁺的内流起作用[23];其可否抑制细胞内钙库释放Ca²⁺还不明确.

生长抑素(somatostatin, SS)是一种脑肠肽, 分布于中枢神经系统及消化道中, 可抑制多种内分泌激素和胃肠胰等消化道外分泌腺体的分泌, 具有广泛的生物活性. 近年的研究显示, SS除了具有广泛的抗分泌作用外, 对小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌等恶性实体肿瘤也具有抑制作用[24,25]. 奥曲肽是人工合成的生长抑素八肽类似物(somatostatin analouges, SSAS), 其作用显著增强, 且半衰期延长, 故更具研究和使用价值. 本研究显示高浓度奥曲肽可显著抑制两株人胃癌细胞的增殖, 与对大肠癌的有效剂量相似[26], 但似乎不如对乳腺癌及小细胞肺癌有效[24].

生长抑素及其类似物的抗增殖机理大致可分为两个方面: 一方面通过抑制可促进肿瘤生长的内分泌激素(如胃泌素、胰泌素、胆囊收缩素)或生长因子(如EGF、IGF-I)等的释放或/和作用发挥间接作用; 另一方面可与靶细胞膜上特异性高亲合力的生长抑素受体结合发挥直接的抗增殖作用. 已知SS有五种亚型的受体, 其中Ⅱ型和Ⅲ型受体可能介导其抗增殖作用[27-29]. 本研究显示高浓度奥曲肽可显著降低胃癌细胞内游离Ca²⁺浓度, 与其抑制细胞增殖的浓度相一致, 提示其抗增殖作用与降低细胞内游离Ca²⁺浓度有关. 已有研究显示[30], SS及SSAS通过百日咳毒素敏感G蛋白与钙通道直接相连, 故可能是抑制了细胞外钙离子的内流而降低了细胞内游离Ca²⁺浓度. 但生长抑素的受体后机制除Ca²⁺通道外, 可能还涉及到环磷酸腺苷(cAMP)和酪氨酸磷酸酶(Tyrosine phosphatase)等其它几个信号传导机制[27,31], 哪一种机制占主导地位抑或这几种机制不过是同一事件的不同阶段, 还有待于进一步研究.

我们研究显示不同浓度的奥曲肽与小剂量Tet联合应用, 其细胞增殖抑制率均显著增加, 其中2.4×10^-12 mol/L低浓度奥曲肽联合Tet对两株胃癌细胞的抑制率更高, P均小于0.01, 提示小剂量Tet联合小剂量奥曲肽对胃癌细胞的抑制作用更强, 目前还无相关的报道, 其中的机制亦不十分清楚. 而在对细胞内钙离子浓度检测的实验中, 联合用药组细胞内钙离子浓度与单独应用Tet组并无显著性差异, 提示奥曲肽增强Tet抗增殖作用可能与降低细胞内钙离子无关, 可能还存在其它的机制.

总之, Tet作为一种中草药来源的生物碱对胃癌细胞的抑制作用显著而稳定, 可能具有多方面的抗癌机制, 且其毒副作用少, 在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景. 奥曲肽单独用于治疗肿瘤所需浓度较高, 两者小剂量联合应用可能为治疗胃癌等消化道恶性肿瘤提供新的思路和方法, 值得进一步体内外研究, 以发扬中药独特的优势.

备注

电编:张勇 编辑:张海宁

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