大鼠肝癌细胞 HSV-tk/GCV 自杀基因系统的构建及其旁观者效应

摘要

目的: 构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统, 建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.

方法: 用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞, 用G418筛选3 wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk, 扩大培养.提取CBRH7919(tk^-), CBRH7919/tk(tk⁺)细胞的DNA, 把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后, 与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交, 以检测tk⁺细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100 mg/L的GCV体外作用于tk^-、tk⁺细胞, MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk⁺细胞的tk⁺、tk^-混合细胞, MTT检测存活率, 比较分析各组旁观者效应大小, 确定后续实验的合适tk⁺比例.

结果: 用G418筛选3 wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk⁺)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交, 检测到tk⁺细胞DNA上已整合有HSV-tk基因, 而tk^-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk⁺细胞生长抑制和细胞毒作用明显, 而且有浓度、时间依赖性, 而tk^-细胞对GCV不敏感, 说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性. GCV对含5%和10%tk⁺的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%, 结果表明5-10%的tk⁺混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低, 而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高, 可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk⁺、tk^-混合比例.

结论: 成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统, 建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

关键词: HSV1-tk/GCV自杀基因系统; 肝癌; 大鼠; 旁观者效应

Construction of HSV-tk/GCV suicide gene system for hepatocarcinoma cells and its bystander effect in rats

Yu-Hui Tan, Ying-Ya Wu, Biao-Yan Du, Yue-Shan Hu, Peng Zhao, Jie-Fen Li

Yu-Hui Tan, Ying-Ya Wu, Yue-Shan Hu, Department of Biochemistry, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Biao-Yan Du, Peng Zhao, Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Jie-Fen Li, Basic Experiment Center of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Supported by: National Science Foundation of China, No. 30171201; and the Fund from Guangzhou Science and Technology Project, No. 2002J1-C7041.

Correspondence to: Biao-Yan Du, Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 12 Jichang Road, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China. tyuhui66@Yahoo.com.cn

Received: June 28, 2005
Revised: July 10, 2005
Accepted: July 16, 2005
Published online: September 15, 2005

Abstract

AIM: To construct the therapeutic system of HSV-tk/GCV suicide gene for hepatocarcinoma cell line, and to establish a cell model and method to examine the effect of HSV-tk/GCV system and its bystander effect.

METHODS: CBRH7919 cells was infected by the active retrovirus particle excreted by the packaging cell line PT67/tk, and then a high anti-G418 clone named CBRH7919/tk was obtained by G418 screening for 3 wk. The total DNAs of CBRH7919 and CBRH7919/tk cells were extracted. The cDNA fragments of HSV-tk were labeled with Digoxin and then hybridized with the DNAs of CBRH7919, CBRH7919/tk cells and positive controls. The CBRH7919 and CBRH7919/tk cells were treated with different concentrations (0.1, 1, 10, 50, and 100 mg/L) of GCV, respectively. The mixture with different ratios of tk positive and negative cells was also treated with GCV. The survival rates of the cells were examined by MTT assay. The bystander effect was analyzed to determine a suitable proportion of tk positive cells for the successive experiments.

RESULTS: A high anti-G418 clone named CBRH7919/tk (tk⁺) was obtained. The HSV-tk gene was detected in the CBRH7919/tk cells, while it was not detected in the CBRH7919 cells. GCV showed significant cytoxicity and inhibition on the proliferation of CBRH7919/tk cells in a concentration- and time-dependent manner. The CBRH7919(tk^-) cells manifested low sensitivity to GCV. The killing rate of GCV to the mixtures containing 5% and 10% tk positive cells were 6.0% and 25.2%, respectively. The sensitivity of MTT assay in the detection of the bystander effect was relatively high, and the bystander effect was low when the mixture contained 5-10% tk positive cells.

CONCLUSION: The therapeutic system of HSV tk/GCV suicide gene for hepatocarcinoma cells in rats is successfully constructed, and the mixed cells containing 5-10% tk positive ones can be used for further study.

Key Words: HSV tk/GCV; Suicide gene system; Hepatocarcinoma; Rats; Bystander effect

0 引言

HSV-tk/GCV对癌细胞的杀伤作用已进入Ⅲ期临床实验[1-4].旁观者效应(bystander effect)是肿瘤自杀基因疗法的突出优点, 筛选旁观者效应增效药物的研究对推进自杀基因疗法的临床应用很有意义[5].我们构建表达HSV-tk基因的大鼠肝癌重组细胞株CBRH7919/tk, 建立针对大鼠肝癌的肿瘤自杀基因tk/GCV系统, 通过测定tk/GCV系统对CBRH7919的杀伤作用和旁观者效应大小, 建立快速筛选旁观者效应增效药物的细胞模型和筛选方法如下.

1 材料和方法

1.1 材料

PLXSN逆转录病毒表达载体购自美国Clontech公司; 重组质粒PLXSN/tk和重组PT67/tk细胞由本研究组构建[5]; 大鼠肝癌细胞株CBRH7919细胞株购自中山大学动物中心细胞库.细胞培养板等耗材购自Corning公司, Polybrene, G418, GCV等为Sigma公司产品; DMEM, RPMI-1640, 胎牛血清为Gibco公司产品; 新生牛血清为杭州四季青公司产品; 高纯度质粒提取、DNA片段凝胶回收、基因组DNA提取等试剂盒购自上海Sangon生物工程技术公司; Dig标记及检测试剂盒购自Roche公司.主要仪器有BNA-3210型CO₂培养箱(日本Espec), 电泳系统(Bio-Rad), 凝胶成像系统(Syngene), 倒置显微镜(重庆COIC), 酶标仪(BioRad), 杂交仪(北京华运).

1.2 方法

细胞培养、复苏、传代、冻存、MTT检测(四甲基偶氮比色法)等实验技术方法参照文献[6-9].将CBRH7919细胞以5×10³个/孔接种于含梯度浓度G418(0, 100, 200, 300, 400, 600, 800 mg/L)的6孔培养板中, 每4 d换液一次, 每天观察细胞, 选用5 d内细胞绝大多数死亡或2 wk内细胞全部死亡的最小G418浓度为筛选浓度.把已转染重组逆转录病毒的PT67/tk细胞复苏, 培养至对数生长期, 收集滴度为4×10⁷ cfu/L的PT67/tk细胞上清液, 经0.45 mm孔径的过滤器过滤, 吸取100 mL加入对数生长期的CBRH7919细胞, 随后加聚季丁胺(polybrene)至终浓度为8 mg/L, 2 d后更换含G418的选择培养液, 连续筛选2 wk后, 获得抗性细胞克隆, 命名为CBRH7919/tk.

1.2.1 点杂交鉴定tk基因对CBRH7919的转染: 按试剂盒说明书方法提取质粒PLXSN/tk的DNA, 经EcoRI/B am HI双酶切后, 用凝胶回收试剂盒回收1.7 kb的tk基因片段, 按Dig标记试剂盒说明书提供的方法用Dig(地高辛)试剂标记tk基因探针、检测标记效率.提取CBRH7919, CBRH7919/tk细胞的DNA, 琼脂糖电泳检查后, 把两种细胞各约1 mg的DNA和1 mg质粒PLXSN/tk的DNA(阳性对照), 热变性后与标记好的tk探针进行杂交、显色反应.

1.2.2 GCV对CBRH7919/tk的杀伤作用: 将CBRH7919(tk^-)和CBRH7919/tk(tk⁺)按每孔5×10³个细胞接种96孔板, 每孔含培养液190 mL, 再分别加入GCV10 mL使GCV终浓度分别为0, 0.1, 1, 10, 100 mg/L, 每孔总体积200 mL, 各6个复孔, 首列6孔为无细胞对照.培养48, 72 h后用倒置显微镜观察细胞的变化, 用MTT法检测tk^-和tk⁺细胞在不同浓度GCV下的吸光度, 计算各组存活率.

1.2.3 tk⁺/tk^-混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响: 用高浓度的750 mg/L G418筛选已被GCV杀伤实验和点杂交鉴定的重组细胞株CBRH7919/tk 3 wk, 以获得对G418高耐药的较纯化的tk+癌细胞集落.按tk⁺细胞占总细胞的0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 100%混合tk⁺和tk^-细胞, 培养12 h后均加入100 mg/L的GCV; 另设不加GCV的tk^-和tk⁺的空白对照组.各组分别置于96孔培养板, 每孔200 mL均接种5×10³个细胞, 每组6个复孔,于37℃, 50 mL/L CO₂培养72 h, 采用MTT法检测存活率.

统计学处理 用SPSS统计软件分析, 两组间比较用LSD法.

2 结果

经对G418的敏感试验确定CBRH7919/tk的筛选浓度为350 mg/L.重组病毒PLXSN/tk转染CBRH7919后筛选3 wk, 获得对G418高耐药性的细胞集落, 命名为CBRH7919/tk(tk⁺细胞), 扩大培养.

2.1 点杂交鉴定tk基因对CBRH7919的转染

tk探针标记效率较高, CBRH7919的DNA不与tk探针杂交, CBRH7919/tk的DNA和重组质粒PLXSN/tk的DNA均与tk探针杂交显色, 说明tk基因已转染CBRH7919并整合到CBRH7919/tk的DNA上.

2.2 GCV对CBRH7919/tk的杀伤作用

倒置显微镜下观察, tk⁺细胞密度随GCV浓度的增高和作用时间增加而逐步减少, GCV10 mg/L以上作用48 h和GCV1 mg/L以上作用72 h的各复孔均见细胞变圆, 胞膜皱缩, 部分细胞脱落悬浮, 并有大量调亡小体及细胞碎片产生, GCV100 mg/L组作用72 h镜下几乎不见存活细胞, 但MTT检测存活率为29.1%.GCV对tk⁺细胞作用72 h的IC50为9 mg/L(图1, 表1).而GCV作用于tk^-细胞时小于100 mg/L各浓度组细胞生长良好, 与空白对照组比较细胞密度、存活率无显著差异.只有GCV达100 mg/L、作用72 h时tk^-细胞才有明显生长抑制, 存活率76.9%(P<0.05 vs对照组, 表1).

表1 GCV对tk⁺和tk^-细胞的作用(mean±SD, n = 3).

细胞	GCV(mg/L)	存活率(%)
		48 h	72 h
1 tk+	0	100±7.1	100±3.7
2 tk+	0.1	95.4±12.1	74.8±6.8b
3 tk+	1	93.2±16.5	63.2±6.0b
4 tk+	10	55.7± 8.2b	49.2±3.0b
5 tk+	100	37.2± 3.4b	29.1±6.4b
6 tk-	0	100±9.3	100±6.7
7 tk-	0.1	97.9±10.5	107.3±5.9
8 tk-	1	92.5±0.7	97.9±11.4
9 tk-	10	100.6 ±12.5	98.8±3.7
10 tk-	100	94.8 ±11.6	76.9±8.2b

^bP<0.01 vs 组1.

图1 GCV 72 h对tk⁺细胞的杀伤作用. A: GCV 0 mg/L; B: GCV 1 mg/L; C: GCV 10 mg/L; D: GCV 100 mg/L.

2.3 tk⁺/tk^-混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响

含0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 100%tk⁺的混合细胞在100 mg/L GCV作用下存活率(%)分别为74.9±10.4, 70.4±2.2, 56.0±5.7, 47.3±2.0, 39.9±9.8, 28.4±2.6, 21.0±2.3, 23.5±1.1.5%tk⁺的混合细胞无明显旁观者效应, 10%tk⁺细胞能杀伤25.2%癌细胞(P<0.05 vs 空白对照组), 已有明显旁观者效应, 70%以上tk⁺的混合细胞与100%tk⁺细胞杀伤率已没有差异(图2).镜下观察到的细胞已从不规则多边形全部变圆, 苔盼蓝计数法检测活细胞也为零, MTT检测存活率却达20%-30%, 明显偏高.镜检发现凋亡小体、细胞碎片也能被MTT染色(图3), 这可能是MTT检测时细胞杀伤程度越高, 结果偏高越严重的原因.

图2 GCV对含不同比例tk⁺的 tk⁺、tk^-混合细胞旁观者效应的影响.

图3 GCV对含不同比例tk⁺的tk⁺、tk^-混合细胞旁观者效应的影响. A: 0%tk⁺; B: 5%tk⁺; C: 10%tk⁺; D: 20%tk⁺; E: 30%tk⁺; F: 50%tk⁺; G: 70%tk⁺; H: 100%tk⁺.

3 讨论

用培养PT67/tk的含病毒上清液感染大鼠肝癌细胞株CBRH7919, 用G418筛选获得了稳定的抗性克隆, 与Dig标记的HSV tk基因探针点杂交实验证明CBRH7919/tk细胞的DNA已整合有HSV tk基因, 而CBRH7919细胞不含HSV tk基因.GCV在体外对CBRH7919/tk癌细胞有明显的杀伤作用, 而对CBRH7919对照组细胞无明显毒性, 表明HSV tk基因已在CBRH7919/tk细胞中表达且产物具有生物活性.以上结果表明已成功构建了针对大鼠肝癌的tk/GCV系统.旁观者效应机制主要有GJIC、细胞凋亡、免疫等介导[5,10-17], 但在细胞水平只能观测到通过GJIC或细胞凋亡等非整体因素介导的旁观者效应, 而不能观测免疫机制介导的旁观者效应.我们建立了检测旁观者效应大小以及筛选其增效药物的细胞模型.从含不同比例tk⁺的混合细胞旁观者效应测定结果看, (1)CBRH7919的自杀基因旁观者效应和已报道的其他细胞系比较, 属于比较低的类型(肿瘤细胞旁观者效应普遍比正常细胞系低), 5%和10%tk⁺的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%, 旁观者效应仅使杀伤率增加了约1%和15%; (2)在5%和10%tk⁺的混合比例下tk/GCV系统自身的旁观者效应程度较低, 有利于观察药物对旁观者效应的诱导促进作用; (3)用MTT法测定旁观者效应的大小变化时在5%和10%这两种比例下检测较灵敏: 5%组、10%组与20%组间存活率有显著差异, 而30-50%组间差异不显著, 70-100%组MTT法测定结果偏高.另外, 10%左右tk⁺的混合比例还能模拟目前临床水平10%左右较低的体内基因转染率, 因此, 结合上述结果我们把5-10%tk⁺确定为下一步体外筛选旁观者效应增效中药成分的tk⁺、tk^-细胞混合比例.

目前, 应用HSV1-tk/GCV系统的基因疗法在国外已进入Ⅲ期临床实验阶段.然而与其他肿瘤基因治疗方案一样, 自杀基因疗法也存在缺乏高效转染载体的问题, 目的基因在体内的转染率仅为10%左右, 大大地影响了肿瘤基因治疗的临床推广应用[18-20].通过寻找天然低毒的中药增强旁观者效应来提高自杀基因疗法的疗效是很有前景的增效策略.另外, 通过细胞凋亡、GJIC等机制增强旁观者效应的药物, 本身也有直接抗肿瘤作用[11-17].因此, 通过调整细胞生理, 诱导肿瘤细胞凋亡, 加强肿瘤与肿瘤细胞、肿瘤细胞与正常细胞之间的GJIC功能, 从而使肿瘤细胞恶性生长逆转, 而且通过提高旁观者效应而增强自杀基因疗效, 有可能为肿瘤治疗提供新途径.

备注

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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