基础研究
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世界华人消化杂志. 2005-09-15; 13(17): 2069-2073
Published online 2005-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i17.2069
大鼠肝癌细胞 HSV-tk/GCV 自杀基因系统的构建及其旁观者效应
谭宇蕙, 吴映雅, 杜标炎, 胡岳山, 赵鹏, 李杰芬
谭宇蕙, 吴映雅, 胡岳山, 广州中医药大学生化教研室 广东省广州市 510405
杜标炎, 赵鹏, 广州中医药大学病理教研室 广东省广州市 510405
李杰芬, 广州中医药大学中医基础实验中心 广东省广州市 510405
谭宇蕙, 女, 1966-04-22生, 广东省恩平市人, 汉族, 2002年广州中医药大学中西医结合专业博士, 副教授, 生化教研室主任, 主要从事中西医结合分子肿瘤学研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30171201; 广州市科技计划项目, No. 2002J1-C7041.
通讯作者: 杜标炎, 510405, 广州市机场路12号, 广州中医药大学病理教研室. tyuhui66@yahoo.com.cn
电话: 020-36585475
收稿日期: 2005-06-28
修回日期: 2005-07-10
接受日期: 2005-07-16
在线出版日期: 2005-09-15
Abstract

目的: 构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统, 建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.

方法: 用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞, 用G418筛选3 wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk, 扩大培养.提取CBRH7919(tk-), CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA, 把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后, 与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交, 以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100 mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞, MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞, MTT检测存活率, 比较分析各组旁观者效应大小, 确定后续实验的合适tk+比例.

结果: 用G418筛选3 wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交, 检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因, 而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显, 而且有浓度、时间依赖性, 而tk-细胞对GCV不敏感, 说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性. GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%, 结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低, 而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高, 可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.

结论: 成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统, 建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

Keywords: HSV1-tk/GCV自杀基因系统; 肝癌; 大鼠; 旁观者效应