修回日期: 2005-03-22
接受日期: 2005-05-25
在线出版日期: 2005-07-28
目的: 筛选HCV非结构蛋白2(NS2)反式调节蛋白(NS2TP)的结合蛋白, 探讨HCV的致病机制及新蛋白NS2TP的生物学功能.
方法: 应用酵母双杂交系统3, 将PCR法扩增的NS2TP基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人白细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖(X-a-gal)上进行双重筛选, 提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序, 结果在GenBank中进行生物信息学分析.
结果: 筛选出与NS2TP结合的蛋白基因25个, 其中包括细胞色素p450 2E1、核心蛋白聚糖、p68、b2微球蛋白、羧肽酶N2等已知功能基因及3个未知功能序列.
结论: 为阐明新蛋白NS2TP的分子生物学功能及HCV的致病机制提供了新的思路.
引文著录: 张黎颖, 成军, 邓红, 郭江, 郭风劲, 王巧侠. 酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库中新基因NS2TP蛋白结合蛋白基因. 世界华人消化杂志 2005; 13(14): 1688-1691
Revised: March 22, 2005
Accepted: May 25, 2005
Published online: July 28, 2005
AIM: To screen the proteins binding to a transregulated protein of hepatitis C virus (HCV) NS2 protein (NS2TP) by yeast two-hybrid technique, and to investigate the pathogenesis of HCV and the biological functions of NS2TP.
METHODS: NS2TP bait plasmid pGBKT7-NS2TP was constructed by ligating the NS2TP gene into yeast expression plasmid pGBKT7. Then pGBKT7-NS2TP was used to transform yeast cells AH109 (a type). Thereafter, the transformed yeast cells were amplified and mated with yeast cells Y187 (a type) containing leukocyte cDNA library plasmid pCAT2 in 2×YPDA medium. The obtained diploid yeast cells were plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) and SD/-Trp-Leu-His-Ade containing x-a-gal for selection twice. The plasmids of positive colonies were extracted and analyzed by DNA sequencing and BLAST search in GenBank.
RESULTS: Twenty-five proteins binding to NS2TP were screened, including cytochrome P450 2E1, decorin, p68, b-2-microglobulin, and carboxypeptidase N precursor (CPN2), etc whose functions had been known. Three proteins with unknown function were screened at the same time.
CONCLUSION: These results bring some new clues for studying the biological functions of the novel gene NS2TP and the pathogenesis of HCV.
- Citation: Zhang LY, Cheng J, Deng H, Guo J, Guo FJ, Wang QX. Screening of proteins binding to NS2TP from leukocyte cDNA library by yeast two-hybrid technique. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(14): 1688-1691
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i14/1688.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i14.1688
NS2TP是我室利用抑制性消减杂交技术从肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中筛选出来的新型蛋白基因, 其开放读码框架(ORF)长度为456个核苷酸(nt), 编码产物由151个氨基酸残基(aa)组成, 我们已经成功的进行了克隆化, 并且应用蛋白免疫印记法(Western blotting)验证在酵母细胞AH109中成功表达融合蛋白. HCV感染可引起肝炎、肝硬化、肝癌、及脂肪肝等, 严重危害着我国的人群健康, 但其致病机制目前还不十分清楚, 我们发现了HCV NS2可下调NS2TP在HepG2细胞中的表达[1-2], 为进一步研究NS2TP是否是HCV引起肝病的一条途径, 本研究应用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中NS2TP蛋白的结合蛋白基因.
AH109酵母菌株(MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4D, gal80D, LYS2:GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2URA3::MEL1TATA-lac Z MEL1)、预转化的cDNA白细胞文库(Y187)、pGBKT7-BD、pGADT7-AD克隆载体及酵母YPD培养基、SD/-Trp、SD/-Leu, SD/-Trp-Leu-His, SD/-Trp-Leu-His-Ade等培养基、X-a-gal购于Clontech公司. 大肠杆菌DH5a为本室保存. Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR I和Pst I购于Takara生物公司. c-Myc mAB本室自制, 由购自ATCC的1-9E10.2杂交瘤产生．辣根过氧化物酶酶标羊抗鼠IgG为中山生物公司产品. 丙烯酰胺、N, N'-亚甲双丙烯酰胺、IPTG及pGEM-T载体购于Promega公司. 醋酸锂、半硫酸腺苷购于Sigma公司. HepG2细胞购于中科院上海细胞生物研究所. NS2TP PCR引物: 有意链:５'-GAA TTC ATG CCG CGT GGA AGC CGA-3',反义链:5'-GGA TCCTTA GGC CAA TCC GTT TGC-3'由上海生工公司合成. DNA测序由上海华诺公司承担.
PCR扩增NS2TP基因与pGEM-T克隆载体连接, 转化大肠杆菌DH5a, 测序正确后, 提取质粒与p GBKT7空载体同时进行EcoR I/BamH I双酶切后将NS2TP连入pGBKT7载体, 转化大肠杆菌DH5a, 应用Vector NTI Suite 8.0分析质粒pGBKT7-NS2TP, 选择内切酶进行酶切鉴定正确后, 醋酸锂法转入酵母菌株AH109, 铺SD/-Trp-His-Ade /kana(4缺+亮氨酸)培养基, 观察2 wk, 排除自激活现象, 同时铺SD/-Trp/kana(缺色氨酸)培养基, 30 ℃孵育5-7 d, 提取酵母蛋白质用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹法验证NS2TP在酵母中的表达. 挑取在SD/-Trp培养基上生长的pGBKT7-HBeAg质粒的酵母AH109单个菌落(2-3 mm)接种于SD/-Trp培养基中, 30 ℃ 250 r/min振摇16-24 h, 紫外分光光度计测OD600 = 0.8-1.0时与1 mL的白细胞文库酵母细胞在50 mL 2×YPDA中30 ℃ 30-50 r/min配合18-24 h, 离心用1×YPDA 8 mL重悬细胞, 分别取220 mL铺于15 cm的SD/-Trp-Leu-His(3缺), SD/-Trp-Leu-His-Ade(4缺)培养基各25块上, 同时将配合产物按1:100、1:1 000、1:10 000铺于SD/-Trp, SD/-Leu, SD/-Trp-Leu培养基上检验配合效率. 30 ℃孵育6-18 d. 挑取大于直径3 mm的菌落再次画线于铺有X-a-gal的4缺培养基上检查X-a-gal酶活性, 在此培养基上能生长且变成蓝色的为真阳性菌落. 按照试剂盒提供的操作指南Lyticase法提取酵母质粒, 转化大肠杆菌DH5a, 于含有氨苄青霉素的SOB平板筛选阳性克隆, BglII酶切鉴定插入200-1 000 bp的序列后进行测序. 结果提交GenBank比对, 进行生物信息学分析.
NS2TP的PCR扩增结果(图1), DNA测序鉴定后EcoR I、BamH I双酶切克隆入酵母表达载体pGBKT7, 应用Vector NTI Suite 8.0分析质粒pGBKT7-NS2TP, 选择PvuII进行酶切鉴定, 应得到三个片段, 分别为:746 bp, 1 993 bp, 5 017 bp(图2). 酶切鉴定结果见图3. 将"诱饵"载体pGBKT7-NS2TP构建后转化到酵母AH109后能够稳定表达NS2TP融合蛋白(图4). 阳性对照组含有DNA结合片段Gal41-147氨基酸及c-Myc标签的总分子量为Mr20 757, 实验组因表达NS2TP融合蛋白为37 518．Western免疫印迹分析结果显示转化pGBKT7质粒组在Mr 201 000后有一特异表达带, 转化pGBKT7-NS2TP质粒的酵母提取物于Mr38 000左右有明显条带．以1:1 000稀释的配合产物在SD/-Trp, SD/-Leu, SD/-Trp-Leu培养基生长的克隆数分别为:57, 81, 7. 计算可得Y187的成活性为5.7×108cfu/L, 为限制部分, 二倍体的成活性为7×107cfu/L, 配合效率为12.3%. 4缺/X-a-gal培养基筛选真阳性菌落(图5). 部分筛选克隆BglII酶切鉴定结果见图6. 挑选42个阳性克隆进行测序, 得到25种已知蛋白基因及3种未知功能基因(表1).
| 序号 | 已知的同源序列编码蛋白 | 相同克隆数 | 同源性(%) |
| 1 | 线粒体基因 | 4 | 98 |
| 2 | b2微球蛋白 | 2 | 100 |
| 3 | 补体1因子 | 1 | 100 |
| 4 | 金属硫蛋白2A | 2 | 100 |
| 5 | contactin 4 | 1 | 100 |
| 6 | 胰岛素样生长因子 | 1 | 99 |
| 7 | 羧肽酶N2 | 1 | 99 |
| 8 | 细胞色素p450 2E1 | 1 | 99 |
| 9 | 载脂蛋白H | 5 | 99 |
| 10 | 硒结合蛋白 | 1 | 100 |
| 11 | CD200细胞表面糖蛋白 | 1 | 100 |
| 12 | 硒蛋白 | 3 | 98 |
| 13 | P68 | 1 | 97 |
| 14 | Zn-α-2糖蛋白 | 3 | 99 |
| 15 | Decorin | 1 | 99 |
| 16 | 丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂 | 1 | 100 |
| 17 | 甘露糖结合蛋白 | 1 | 100 |
| 18 | 激肽原 | 1 | 99 |
| 19 | 乙酰乙酰ＣｏＡ硫解酶 | 1 | 100 |
| 20 | Ga黏素 | 1 | 100 |
| 21 | 纤维蛋白原 | 1 | 100 |
| 22 | 真核翻译起始因子3 | 1 | 97 |
| 23 | 甘胺酸脒基转移酶 | 1 | 98 |
| 24 | 白蛋白 | 2 | 100 |
| 25 | 血管紧张素原 | 1 | 97 |
| 26 | 未知功能基因1-3 | 3 | 97-100 |
酵母双杂交系统3, 利用a型和a型酵母配合形成二倍体细胞内诱饵质粒与文库质粒所表达的蛋白质可以相互作用的原理, 免去了需要共转染文库质粒与诱饵质粒所带来的低效率问题．而且由于有3个报告基因用来筛选及严格的对照阳性率达到95%以上. 本研究组应用抑制性消减杂交技术发现、注册并体外克隆了HCV NS2反式调节新基因NS2TP, 为研究NS2TP的生物学功能, 我们采用酵母双杂交技术筛选了白细胞文库中NS2TP蛋白结合蛋白的基因, 得到细胞色素p450 2E1(CYP2E1)、核心蛋白聚糖(Decorin, DCN)、P68、b2微球蛋白、羧肽酶N2, 金属硫蛋白2A, 胰岛素样生长因子、纤维蛋白原等, 均在细胞因子相互作用网络中具有重要的作用, 与生物信息学分析结果一致, 下面对部分结合蛋白的功能进行阐述.
CYP2E1属P450(CYP)超家族, 是一类重要的氧化代谢酶, 他不仅参与催化多种外源性物质, 如小分子溶剂、癌前物质和药物, 而且参与内源性物质的代谢, 如脂肪酸和酮体[1].CYP2E1可被乙醇诱导, 同其他细胞色素P450相比, 可以产生更多的活性氧, 如超氧自由基和H2O2, 在酒精性肝病的机制中起到重要作用. 除此外, 游离脂肪酸(FFA)也是CYP2E1的重要底物之一, 可诱导CYP2E1升高, 脂质过氧化加剧, 导致抗氧化能力减弱, 氧化与抗氧化机制失衡的结果是自由基的生成增多, 自由基不但氧化细胞膜的脂质, 更重要的是氧化细胞膜的蛋白, 最终导致肝细胞结构与功能的损害, 因此CYP2E1也被认为与非酒精性脂肪肝的预后密切相关[2]. 戴军et al[3]研究发现正常肝组织内, CYP2E1表达仅见于中央静脉周围区, 主要表达于肝腺泡III区, 肝细胞质和细胞膜可见CYP2E1表达, 但在CCL4模型肝组织中, 其表达强度增加, 分布的方式亦发生改变, 可见于肝腺泡I和II区, 与肝细胞脂肪变分布相一致, 在假小叶的肝细胞中不见表达, 认为CYP2E1表达与肝纤维化发生有关. 而NS2TP可能作为HCV NS2与CYP2E1作用的中间桥梁, 其具体的作用有待于进一步研究.
除CYP2E1外, 我们还对DCN很感兴趣, 他属于小分子、间质性、富含亮氨酸蛋白聚糖家族成员, 是一种多效性分子, 有抑制细胞生长的作用, 参与构成调控细胞增殖的负反馈环路. 研究表明, DCN和细胞膜上细胞胞外液(ECF)受体结合, 启动了MAP激酶/P21等的信号转到途径[4]. Kotaka et al[5]证明肝癌细胞和正常肝细胞相比DCN表达明显下降. 而HCV NS2下调NS2TP的表达, 是否使其对DCN抑制细胞生长的协同作用减弱, 导致肝炎后肿瘤的发生. P68是另一个与NS2TP结合的重要蛋白, 他的首次发现是因为他与SV40大T抗原有免疫交叉反应[6], 属于DEAD盒RNA解旋酶超家族, 具有高度保守性, 定位于细胞分裂末期的新鲜核仁, 参与RNA的剪切、加工、转录和翻译, 具有重要的功能. 研究发现[7], HCV NS5B可与内源性P68相互作用, NS5B的过表达可引起P68的重新分布, 即从核仁到胞质. 在转染HCV RNA全长基因的细胞中, 采用siRNA技术敲除内源性P68基因, 结果发现以正链RNA为模板形成的负链RNA显著减少, 而在NS5B过表达的细胞中, 虽保留P68基因仍然可引起负链RNA显著减少, 推测NS5B可与P68结合从而阻断P68与病毒复制酶的作用, 引起病毒复制减少. 而在我们的研究中, 作为NS2下调的蛋白NS2TP也可与P68结合, 究竟有发挥着什么作用, 是否是HCV NS2下调NS2TP蛋白, 使P68释放, 从而催化病毒复制酶的活性, 使病毒复制得以顺利进行.
总之, NS2TP可能介导HCV病毒和宿主相互作用, 是各种导致病毒清除和慢性感染以及肝病发生发展过程中很重要的一个环节, 而作为一种新基因, 对他的进一步研究将为阐明HCV感染及慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的病理机制提出新的思路.
编辑:潘伯荣 审读:张海宁
| 1. | Lieber CS. Cytochrome P-4502E1: its physiological and pathological role. Physiol Rev. 1997;77:517-544. [PubMed] |
| 2. | Chalasani N, Gorski JC, Asghar MS, Asghar A, Foresman B, Hall SD, Crabb DW. Hepatic cytochrome P4502E1 activity in nondiabetic patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2003;37:544-550. [PubMed] [DOI] |
| 3. | 戴 军, 陆 伦根, 曾 民德, 李 继强, 华 静, 茅 益民, 范 竹萍, 彭 延申, 邱 德凯. 肝细胞色素P450 2E1在实验性肝纤维化组织中的表达. 肝脏. 2000;5:16-17. |
| 4. | Hino N, Higashi T, Nouso K, Nakatsukasa H, Tsuji T. Apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma. Liver. 1996;16:123-129. [PubMed] [DOI] |
| 5. | Kotaka M, Chen GG, Lai PB, Lau WY, Chan PK, Leung TW, Li AK. Analysis of differentially expressed genes in human hepatocellular carcinoma using suppression subtractive hybridization. Br J Cancer. 2001;85:228-234. [PubMed] [DOI] |