修回日期: 2005-03-05
接受日期: 2005-03-16
在线出版日期: 2005-06-15
目的: 探讨慢性乙型肝炎患者外周血T细胞亚群CD28分子的表达及血清IL-2、IL-10、IL-12和IFN-γ的含量与中医辨证分型之间的相互关系．
方法: 选择本院门诊和住院的慢性乙型肝炎患者124例、正常对照人群20例, 采用流式细胞术检测外周血CD4+、CD8+ T细胞的CD28分子表达水平; 以ELISA方法检测患者及对照组血清中部分细胞因子IL-2、IL-10、IL-12和IFN-γ的水平, 结合中医辨证分型进行分析, 从免疫学角度探讨二者相互关系．
结果: 所观察的CD28、CD4和CD4/CD8各组中, 慢性乙型肝炎的中医辨证分型各组与正常对照组具有显著差异(P<0.05), 分型的各组总体和组间差异均具统计学意义(P<0.05或0.01).从CD28+CD8+看, 湿热中阻组明显升高, 而其余三组则与正常组相似; 从CD28+CD4+看, 肝郁脾虚、湿热中阻两组与正常组虽无明显差异, 但其应答强弱顺序颇能说明问题, 即肝肾阴虚组>湿热中阻组 、肝郁脾虚组>瘀血阻络组.细胞因子检测结果在分型各组中总体有差异, 具体统计学比较值(P<0.05或0.01).肝肾阴虚和瘀血阻络两组中IFN-γ水平与其他组有显著差异(P<0.05).
结论: 慢性乙型肝炎中医分型各组的CD28表达水平以及部分细胞因子水平与正常相比, 有显著差异, 中医分型各组间亦有一定差异. 综合分析和评价免疫细胞的表面分子、细胞因子的检测结果与中医辨证分型之间的关系, 对阐明中医病机的实质有重要价值．
引文著录: 施维群, 缪锡民, 黄茵, 陈智. 慢性乙型肝炎患者外周血T细胞标记物表达及细胞因子水平与中医分型的关系. 世界华人消化杂志 2005; 13(11): 1364-1367
Revised: March 5, 2005
Accepted: March 16, 2005
Published online: June 15, 2005
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(11): 1364-1367
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i11/1364.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i11.1364
Th1/Th2细胞在慢性乙型肝炎的过程中的作用日益受到关注, 其免疫应答与乙型肝炎的关系成为近年研究的热门.目前由于缺乏特异性较高、操作简单的标记物检测来确定Th1/Th2值以及代表的细胞因子含量, 故开展这方面的研究具有积极的意义.为了阐明Th1/Th2细胞在慢性乙型肝炎中的作用, 探讨其在中医临床分型中的相互关系, 我们用流式细胞仪对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞标记物CD8+、CD4+细胞的CD28分子表达进行测定, 并用ELISA法测定血清中的IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ等的含量, 探究其与中医分型的结合点, 具有一定的临床意义.
本院住院和门诊的慢性乙型肝炎患者124例, 其中男性76例, 女性48例, 年龄16-63岁, 平均32.77岁.病程1-3年的32例; 3-5年的58例; 5-10年的21例; 10年以上的13例, 平均病程5.67年.对照组20例, 选自门诊健康体检者.其中男性13例, 女性7例, 平均35.8岁, 均排除其他病毒性肝炎、免疫性疾病及近3 mo内应用影响免疫功能的药物.两组在年龄、性别等方面无统计学差异.诊断标准: 参照2000-09西安第十次全国传染病寄生虫病学术会议制定的标准[1], 中医辨证则参照全国中医药学会内科肝病专业委员会1991-12月天津会议制定的中医辨证分型标准〈试行〉[2].中医分型及疾病分类: 124例患者分为湿热中阻型25例; 肝郁脾虚型49例; 肝肾阴虚型22例; 瘀血阻络型26例; 脾肾阳虚型2例; 由于脾肾阳虚型仅为2例, 在统计学中意义不大, 故予以忽略不计, 实际病例为122例.将中医分型结合以慢性乙型肝炎轻、中、重的三型按顺序分类见表1.主要仪器设备和试剂: 美国METERTECH公司自动酶标检测仪, 型号为Σ960; 深圳晶美公司进口分装的双抗体夹心ELISA试剂盒.流式细胞仪(EPICS-XL, 美国BECKMAN COUTER公司生产), FITC, PE及cy5-PE荧光标记单克隆抗体(美国EXALPHA公司生产), 免疫学标本制备仪(EPICS-Q-PREP, 美国Couler公司生产).
| 慢乙肝轻度(%) | 慢乙肝中度(%) | 慢乙肝重度(%) | |
| 肝郁脾虚 | 27(55.1%) | 18(36.7%) | 4(8.2%) |
| 湿热中阻 | 10(40.0%) | 9(36.0%) | 6(24.0%) |
| 肝肾阴虚 | 7(32.0%) | 9(41.0%) | 6(27.0%) |
| 瘀血阻络 | 5(19.0%) | 9(35.0%) | 12(46.0%) |
| 脾肾阳虚 | 1(50.0%) | 1(50.0%) | 0(0%) |
1.2.1 流式细胞检测: 100 μL抗凝静脉全血, 分别加入: 鼠抗人Gcy5-PCD4-FITC, CD28-PE和CD8-cy5-PE各10 μL, 阴性对照管中加入鼠IgG-FITC, IgG-PE和IgE各10 μL.混匀置室温20℃避光孵育20 min, 用免疫学标本制备仪进行溶血, 固定等上机前处理后, 上流式细胞仪做三色荧光流式细胞检测.然后以不同双荧光素标记组合方式分析CD28-CD4, CD28-CD8, CD4-CD8的T细胞亚群, 每次每样本淋巴细胞计数均>104个.
1.2.2 ELISA法检测细胞因子: 抽取静脉血并于当日离心取血清, 一部分冻存于-20℃备检, 另一部分做常规肝功能检查.从-20℃中取出的血清标本在室温下融化后, 严格按双抗体夹心ELISA试剂盒说明操作, 分别检测IL-2, IL-10, IL-12及IFN-γ水平.
统计学处理 所有数据均采用mean±SD表示, 多组间比较用Q检验, P<0.05为差异有显著意义.
2.1 慢性乙型肝炎患者的CD28+CD4+、CD28+CD8+及CD4/CD8细胞数见表2.
2.2 慢性乙型肝炎患者血清中细胞因子的含量详见表3.分型各组总体有差异P<0.05.其中肝郁脾虚与湿热中阻两组也有差异P<0.05或P<0.01.IFN-γ水平则肝肾阴虚和瘀血阻络与其他两组有显著差异P<0.01.
现代医学认为乙型肝炎慢性化与宿主免疫应答低下或形成的免疫耐受密切相关, T细胞表面的CD28分子与其配体B7结合在诱导机体免疫应答及防止形成免疫耐受方面起重要作用[3].慢性乙型肝炎病毒感染的治疗目标最终取决于免疫清除HBV, 这又取决于HBV抗原诱导体液免疫产生的抗体是否清除循环和体液中的游离病毒, 以及细胞免疫产生的特异性细胞毒T细胞(CTL)能否清除肝细胞内的病毒, 因此免疫应答成为肝细胞损伤的主要机制.尽管目前认为HBV持续感染与机体形成对HBV的免疫耐受密切相关, 但其感染慢性化的机制至今还未完全清楚.于是我们将外周血T细胞CD28表达、细胞因子水平与中医的体质观结合, 探讨其与辨证分型、疾病预后及治疗的意义.
HBV的HBsAg是严格的胸腺依赖抗原(TD-Ag)[4], 只有在T细胞CD28分子和其配体B7结合的共同刺激信号作用下才能使辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)充分活化、增殖、分泌细胞因子及产生CTL应答.若缺少B7-CD28的作用, 则可能导致特异性克隆失活, 形成免疫耐受[5].所以, CD4+ CD28+ T细胞和CD8+ CD28+ T细胞可能为形成正免疫应答的Th细胞和CTL细胞.CD28主要分布于成熟的T细胞, 人外周血中95% CD4+ T细胞和50% CD8+ T细胞均有表达, 活化的T细胞表达也会增加.中医相当重视人体的体质学, 其病理过程归属于人正气与邪气的互动, 这一过程与现代医学中人体的免疫功能变化有共同之处.
慢性乙型肝炎中医辨证分型各组的CD28表达水平与正常对照相比, 有显著差异, 各组间也有一定差异.中医辨证分型主要是通过临床症状、脉象、舌象等窗口观察结果的综合分析, 如能结合肝功能变化、病变程度、症状轻重、免疫应答水平等综合考量, 无疑更具有临床意义.有实验提示, CD28+ CD8+的CTL的细胞毒作用参与了肝细胞损伤.HBV慢性感染者均有一定程度的肝损伤, 只不过常规的肝功能不易检出而已.慢性肝炎的外周血CD28+ CD8+的抑制性细胞(TS)减少, 可能是CTL比例增加之故.因此CD28+ CD8+细胞可能代表细胞免疫应答程度, 故其升高常常表现为ALT升高, 机体对HBV抗原的免疫清除也相应增强.我们从临床观察看到, 表现为湿热中阻、肝肾阴虚的慢性乙型肝炎往往有明显的炎症反应.以我们过去称之的"慢性活动性肝炎"患者多见, 中医证见以实证及虚实夹杂为多.表1亦提示, 两型中的慢性乙型肝炎中、重度患者占60%以上, CD28+ CD4+细胞被认为是有效的Th细胞, 他有增强CTL细胞免疫应答水平的一面.因此本组久治不愈, ALT升高又不明显的患者, 则以肝郁脾虚类型居多, 即过去称之为"慢性迁延性肝炎"的患者, 中医证见以虚证为多见.对于那些表现为瘀血阻络的慢性乙型肝炎更是以代偿性肝硬化居多, 这是由于肝纤维化形成后其应答程度反有所降低所致.
总之, 从CD28+ CD8+看, 以湿热中阻型的人明显为高, 而其余三组则与正常组相似; 从CD28+ CD4+看, 肝郁脾虚、湿热中阻型的与正常组虽无明显差异, 但按其应答强弱顺序也能说明一些问题: 即肝肾阴虚组>湿热中阻组、肝郁脾虚>瘀血阻络组.因此, 慢性乙型肝炎患者的外周血CD4+ T细胞、CD8+ T细胞CD28分子表达状况与中医辨证中的证型关系, 特别是虚证和实证或虚实夹杂证的互动关系, 可对临床诊断、治疗提供一定的理论和实验依据.
参与肝脏炎症反应的细胞因子从理论上讲以IL-2、IL-12和IFN-γ等为TH1细胞的代表, 其中IL-12又可诱导Th1相关的细胞因子产生.这些细胞因子在某种程度上通过调节来决定免疫应答的性质, 涉及免疫和炎症的每一个环节.故Th1/Th2的平衡状态在一定程度上反映出HBV感染后机体的免疫应答状态.Th由Th0向Th1和Th2亚群进行分化, Th1通过分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等主要促进细胞免疫[6].IFN-γ又可增强IL-12的产生, 二者在调节Th1细胞亚群分化上具有协同作用.IL-10则是一种双抑制的反馈因子, 对Th细胞增殖有双向调节作用, 可防止机体细胞因子过度形成导致的不良后果, 并具有抗炎作用.
本辨证分型各组, 其细胞因子的水平较正常对照组有不同程度的升高, 且各证型之间也有明显差异.就IL-2、IL-10、IL-12来看, 肝郁脾虚和湿热中阻两型升高明显, 而肝肾阴虚和瘀血阻络两型则表现为轻度升高; 反之IFN-γ则以肝肾阴虚和瘀血阻络两型升高为主.一般而言, 在Th1/Th2模式细胞因子中, 同一模式的各种细胞因子(如IL-2、IFN-γ与IL-12或IL-10等的浓度)未必均表现增高或降低, 但若表现为同步增高, 其临床意义就值得重视.慢性乙型肝炎各证型组间细胞因子水平的差异, 也比较客观地反映出不同病种、不同程度及不同症状等所反映的相应免疫水平变化.慢性乙型肝炎中以肝肾阴虚和湿热中阻两型炎症反应较重, 因而其免疫应答反应相对较为剧烈, 此时面临着彻底清除病毒及较为严重的免疫损伤两种选择.从各分型组中的慢性乙型肝炎轻、中、重比例变化来看, 随着炎症程度的加重, 持久的免疫应答过程往往导致肝纤维化的形成, 此时炎症反应并非主导因素, 取而代之的是缠绵不断的细胞增殖过程.慢性乙型肝炎重度以瘀血阻络组为最高, 其次为肝肾阴虚组, 恰恰两组的IL-2、IL-10、IL-12水平较肝郁脾虚和湿热中阻组为低, IFN-γ水平则明显高于后两组.IL-10水平往往随着肝功能的恶化或纤维化进程而越来越低, 这提示, IL-10的缺乏促进了肝纤维化的形成[7].IFN-γ水平增高则提示, 旷日持久的免疫应答, 往往紧接着一个肝纤维化的过程.许多研究结果表明, IFN-γ可以抑制成纤维细胞胶原的合成[8].因此有学者提出了"IFN-γ在肝纤维化前期增高不显著, 后期上升较明显, 其对肝纤维化发展是有一定的制衡作用"的观点[9].从临床看, 本组124例患者的病程短则1年, 长则10年以上, 平均5.67年, 故其从慢性肝炎到肝纤维化、肝硬化的过程中, 多数是有着肝郁脾虚、湿热中阻向肝肾阴虚和瘀血阻络这些中医证型转变过程的, 也就是说, 病变有虚证向实证、虚实夹杂最后再到虚证的发展规律的.
总之, 慢性乙型肝炎患者外周血T细胞标记物表达及细胞因子水平的免疫学的意义与中医学理论中"邪正相争"的剧烈反应、"邪恋正虚"的轻微反应以及"久病必瘀"、"久病属虚"的相对静止期有较为相似之处.肝脏炎症反应的强弱、纤维化程度的高低, 与中医的"瘀、虚"有相当的关系.综合分析和评价免疫细胞的表面分子、细胞因子的检测结果与中医辨证分型之间的关系, 对阐明中医病机的实质有重要价值.
编辑:徐协群 审读:张海宁
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