修回日期: 2005-02-05
接受日期: 2005-03-03
在线出版日期: 2005-06-15
目的: 用荧光定量PCR(FQ-PCR)和逆转录PCR(RT-PCR)法检测抗-HCV阳性血清中的HCV RNA, 探讨两种方法检测结果的临床意义.
方法: 抗-HCV阳性血清样本1062份, 其中481份用RT-PCR法检测, 465份用FQ-PCR法检测, 另有116份同时用两种PCR法检测.
结果: RT-PCR法检测HCV RNA的阳性率为49.90%(240/481), FQ-PCR法的阳性率为62.58%(291/465), 两种方法的阳性率有显著性差异(P<0.001).同时用两种方法检测116份, RT-PCR法阳性率为49.14%(57/116), FQ-PCR法阳性率为65.52%(76/116), 也有显著性差异(P<0.05).FQ-PCR法检测的40份阴性中RT-PCR法检测出4例HCV RNA阳性.
结论: FQ-PCR检测HCV RNA比RT-PCR特异性高, 但RT-PCR的敏感性较FQ-PCR高, 部分FQ-PCR检测的阴性结果不能排除HCV RNA阳性的可能性.
引文著录: 张英哲, 金仁顺, 朴东明, 沈哲式. 荧光定量PCR与逆转录PCR检测HCV RNA的比较分析. 世界华人消化杂志 2005; 13(11): 1349-1350
Revised: February 5, 2005
Accepted: March 3, 2005
Published online: June 15, 2005
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(11): 1349-1350
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i11/1349.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i11.1349
近年来出现的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术开辟了从定性到定量的新途径, 他以其独特的优点逐渐成为临床和科研中的重要工具, 但仍存在不足之处[1].我们采用逆转录PCR(RT-PCR)和FQ-PCR检测了抗-HCV阳性血清946例的HCV RNA, 同时用两种方法检测了116例, 以评价两种PCR法检测结果的临床意义.
2002-07/2004-12来我院门诊及住院患者, 利用ELISA法检测的抗-HCV阳性血清标本共1062份; RT-PCR法使用华美生物工程公司提供的HCV RNA PCR酶免检测试剂盒, 主要仪器有PCR扩增仪(PTC100型)和酶标仪(Bio Rad 550型).FQ-PCR法使用深圳匹基生物工程公司提供的HCV RNA荧光定量检测试剂盒, 主要仪器有日本大和荧光定量PCR(FQD-33A)检测系统.
1.2.1 RT-PCR法检测: 2002-07/2003-04的481份标本利用酶标仪检测结果, 选双波长(450/630)进行比色, 读取A值, 结果判定: Cutoff = 阴性对照A值×2.1(阴性对照A值低于0.05时按0.05计算), 标本A值≥Cutoff值时, 判定为HCV RNA阳性, 每次检测均设阴性和阳性对照.
1.2.2 FQ-PCR法检测: 2004-04/09的465份标本样品检测结果低于最低检出限时报告为<106 copies/L; 检测结果>106 copies/L时直接报告, 检测的拷贝范围为106-1011 copies/L.每次试验均设阴性、阳性和峰值对照, 相关系数r≤-0.980.
1.2.3 2004-10/12的116份标本同时用两种PCR法检测.两种PCR法的实验操作和检测结果, 均严格按试剂盒说明书进行操作和分析.
统计学处理 采用SPSS10.0系统分析软件进行数据处理, 两组率比较采用χ2检验.
RT-PCR 检测的HCV RNA阳性率为49.90%(240/481), FQ-PCR 法的阳性率为62.58%(291/465), 二者比较有显著性差异(χ2 = 15.449, P<0.001, 表1).
HCV感染是世界范围的健康问题[2].在美国, HCV是慢性肝病、肝硬化和肝细胞性肝癌的最常见的原因[3], 在亚洲国家其重要性在增加[4], 我国的HCV 感染率也相当高[5]．目前抗-HCV抗体在筛查慢性HCV感染者方面发挥了重要的作用, 现行的抗-HCV诊断试剂的特异性超过99%, 但由于缺少金标准而难以明确其敏感性[6], 显著一部分阳性结果为假阳性[7], 邢文革et al[8]认为筛查实验的特异性方面, 丙肝抗体酶联免疫检测试剂的特异性并不如想象中的高, 许多筛查试验阳性者并无HCV感染, 为假阳性结果.
外周血中检出HCV RNA是HCV复制活跃的可靠指标, HCV RNA检测包括定性和定量两种方法, 定性PCR检测技术操作繁琐耗时, 易交叉污染而出现假阳性, 检出率较低等, 因此该检测方法的应用受到一定程度限制.近年来发展的荧光定量PCR技术因其具有操作简便、减少了污染和准确定量等优点被临床广泛采用.两种检测方法相比较, 定性PCR灵敏度高于定量PCR[9].
近年来国内陆续有应用两种PCR法检测HCV RNA的报道, 但选择的样本不同, 使用的仪器、试剂和检测结果的方法不同, 得出的结果有差异[10-13].本组检测二次的定性PCR阳性率(49.90%、49.14%)和定量PCR的阳性率(62.58%、65.52%)基本相似, 无明显波动, 表明试剂和仪器性能稳定, 技术操作规范.我们检测的结果表明, RT-PCR检测的阳性率为49.90%, FQ-PCR的阳性率为62.58%, 后者阳性率高于前者, 有显著性差异(P<0.001), 与张淑云et al[11]报道的阳性率(68.3%)相似(同一厂家试剂), 表明FQ-PCR的特异性较RT-PCR高.本实验采用的试剂检测的定量范围(106-1011copies/L)较宽, 在抗病毒药物的治疗前和治疗过程中定期检测HCV RNA含量, 有利于药物疗效的动态观察.我们还用两种PCR法同时检测了116份样品, 同样FQ-PCR的阳性率高于RT-PCR法.二者比较也有显著性差异(P<0.05).在FQ-PCR检测的40份阴性样品中用RT-PCR检测出4份阳性, 王平忠 et al[13]报道定量阴性30例中定性阳性6例, 表明了定性(RT-PCR)检测的灵敏度高于FQ-PCR检测, 因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎的诊断, 而定量PCR则用于疗效检测[9].我们使用的FQ-PCR检测试剂最低检测限为106 copies/L, 如样本中HCV RNA的量<106 copies/L时可能检测不出, 因此FQ-PCR检测HCV RNA的结果阴性时不能轻易排除病毒血症水平低于检测极限的可能性, 应重复用定性PCR检测, 以免漏诊病毒感染处于活跃期的患者.与HBV DNA相比, HCV RNA的检测更为复杂和困难, 且检出率较低, 同一份临床样本不同检测方法所得结果不同, 王宇明[14]提出HCV RNA的PCR检测应强调规范化, 应采取的措施有; 空腹条件下抽血、及早分离血清和检测、避免标本反复冻融, PCR的整个过程应避免RNA酶及DNA酶对标本的降解和对模板的污染.定量PCR技术已被临床广泛采用, 定量结果为临床判定疗效提供了依据, 但不能用定量PCR代替定性PCR以诊断丙型肝炎, 可能会造成丙型肝炎的漏诊, 应引起重视.
编辑: 张海宁
| 1. | 张 蓓, 沈 立松. 实时荧光定量PCR的研究进展及其应用. 国外医学临床生物化学与检验学分册. 2003;24:327-329. |
| 2. | Cook L, Ng KW, Bagbag A, Corey L, Jerome KR. Use of the MagNa pure LC automated nucleic acid extraction system followed by real-time reverse transcription-PCR for ultrasensitive quantitation of hepatitis C virus RNA. J Clin Microbiol. 2004;42:4130-4136. [PubMed] [DOI] |
| 3. | Afdhal NH. The natural history of hepatitis C. Semin Liver Dis. 2004;24:3-8. [PubMed] [DOI] |
| 4. | Chaudhuri S, Das S, Chowdhury A, Santra A, Bhattachrya SK, Naik TN. Molecular epidemiology of HCV infection among acute and chronic liver disease patients in Kolkata, India. J Clin Virol. 2005;32:38-46. [PubMed] [DOI] |