大肠癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-09-15; 12(9): 2070-2073
在线出版日期: 2004-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i9.2070
大肠上皮恶性转化不同阶段中Fas, p53表达及其与凋亡的关系
孙保存, 赵秀兰, 王展宏, 刘易欣, 王欣, 古强
孙保存, 王展宏, 天津医科大学肿瘤研究所 天津市 300060
赵秀兰, 刘易欣, 王欣, 古强, 天津医科大学病理教研室 天津市 300070
孙保存, 男, 1950-11-06生, 天津市人, 汉族, 1977年天津医学院本科毕业, 1986年天津医学院硕士研究生毕业, 教授、博导, 主要从事大肠癌及消化系统疾病的研究.
基金项目: 天津市科委重大攻关项目, No. 003119711.
通讯作者: 孙保存, 300060, 天津市河西区体院北环湖西路, 天津医科大学肿瘤研究所. baocunsun@eyou.com
电话: 022-23542581
收稿日期: 2004-03-18
修回日期: 2004-05-09
接受日期: 2004-05-24
在线出版日期: 2004-09-15

目的: 研究大肠腺癌、腺瘤恶变、管状绒毛状腺瘤、管状腺瘤中Fas及p53的表达, 探讨Fas在大肠癌发生发展中的作用.

方法: 收集石蜡包埋的大肠腺癌组织37例, 腺瘤恶变组织26例, 管状绒毛状腺瘤30例, 管状腺瘤24例, 以6例非肿瘤大肠黏膜作为对照. 通过原位杂交, 免疫组化及TUNEL等技术, 原位观察不同病变组织大肠上皮中的Fas mRNA和p53蛋白表达及细胞凋亡的状况及相互关系.

结果: Fas mRNA 阳性细胞密度: 非肿瘤黏膜39.60±6.51, 管状腺瘤50.93±21.64, 管状绒毛状腺瘤45.91±24.15, 腺瘤非恶变区25.47±14.76, 腺瘤恶变区11.92±9.47, 腺癌5.88±5.10; Fas mRNA在腺瘤中有较高表达, 而在恶性病变中表达明显下降(P <0.001). 大肠非肿瘤黏膜、管状腺瘤、管状绒毛状腺瘤、腺瘤非恶变区、腺瘤恶变区和腺癌中p53蛋白阳性细胞密度分别为8.40±2.67, 13.19±8.95, 13.50±7.29, 12.24±7.16, 73.31±28.57和 80.99±44.54; p53蛋白在非肿瘤黏膜中表达最低, 腺瘤中略增加, 在恶性病变中明显增加(P <0.001). 上皮凋亡细胞密度: 非肿瘤黏膜15.02±11.14, 管状腺瘤46.31±18.86, 管状绒毛状腺瘤29.43±16.66, 腺瘤非恶变区68.42±19.61, 腺瘤恶变区22.01±12.07, 腺癌18.64±12.88; 上皮凋亡细胞密度在腺瘤中明显升高, 在恶性病变中较低(P <0.001). p53蛋白阳性表达细胞密度与上皮凋亡细胞密度呈负相关(r = -0.389, P <0.001), Fas mRNA阳性表达细胞密度与上皮凋亡细胞密度呈正相关(r = 0.190, P <0.05).

结论: 本文证实大肠腺癌可通过下调Fas表达, 上调p53表达, 抑制细胞凋亡, 形成"Fas抵抗".

关键词: N/A
引文著录: 孙保存, 赵秀兰, 王展宏, 刘易欣, 王欣, 古强. 大肠上皮恶性转化不同阶段中Fas, p53表达及其与凋亡的关系. 世界华人消化杂志 2004; 12(9): 2070-2073
Expression of Fas and p53 in different stages of large intestinal malignant transformation and their association with apoptosis
Bao-Cun Sun, Xiu-Lan Zhao, Zhan-Hong Wang, Yi-Xin Liu, Xin Wang, Qiang Gu
Bao-Cun Sun, Zhan-Hong Wang, Tianjin Medical University Institute of Oncology, Tianjin 300060, China
Xiu-Lan Zhao, Yi-Xin Liu, Xin Wang, Qiang Gu, Department of Pathology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by: the Major Brainstorm Project of Tianjin Scientific and Technological Committee, No. 003119711.
Correspondence to: Dr. Bao-Cun Sun, Tianjin Medical University Institute of Oncology, Huanhuxi Road, Tiyuanbei, Hexi District, Tianjin 300060, China. baocunsun@eyou.com
Received: March 18, 2004
Revised: May 9, 2004
Accepted: May 24, 2004
Published online: September 15, 2004

AIM: To explore the expression of Fas and p53 in the large intestinal adenocarcinoma, malignantly transformed adenoma, tubulo-villous adenoma, and tubular adenoma, and to assess their influence on the pathogenesis of large intestinal carcinoma.

METHODS: Using in-situ hybridization, immunohistochemistry and TUNEL techniques, we examined a number of paraffin-embedded tissues including 37 cases of large intestinal adenocarcinomas, 26 cases of malignantly transformed adenomas, 30 cases of tubulo-villous adenomas, and 24 cases of tubular adenomas for Fas mRNA, p53 protein and DNA fregment. 6 cases of non-tumor mucosa were used as control group.

RESULTS: Fas mRNA positive cell density was: 39.60±6.51 in non-tumor mucosa, 50.93 21.64 in tubular adenoma, 45.91±24.15 in tubulo-villous adenoma, 25.47±14.76 in non-malignantly transformed area of adenoma, 11.92±9.47 in malignantly transformed area of adenoma, and 5.88±5.10 in adenocarcinoma, which was significantly lower in the malignant lesions than in adenomas (P <0.001). p53 protein positive cell density was: 8.40±2.67 in non-tumor mucosa, tubular adenoma 13.19±8.95, tubulo-villous adenoma 13.50±7.29, non-malignantly transformed area of adenoma 12.24±7.16, malignantly transformed area of adenoma 73.31±28.57, adenocarcinoma 80.99±44.54, among which it was the lowest in the non-tumor mucosa, slightly increased in adenoma, and significantly increased in malignant lesions (P <0.001). Apoptotic cell density was: non-tumor mucosa 15.02±11.14, tubular adenoma 46.31±18.86, tubulo-villous adenoma 29.43±16.66, non-malignantly transformed area of adenoma 68.42±19.61, malignantly transformed area of adenoma 22.01±12.07, adenocarcinoma 18.64±12.88, which was higher in adenomas, but lower in malignant lesions (P <0.001). The positively expressed cell density of p53 protein was reversely related with that of the apoptotic epithelial cells (r = -0.389, P <0.001). The positively expressed cell density of Fas mRNA was related with that of the apoptotic epithelial cells (r = 0.190, P <0.05).

CONCLUSION: The apoptotic cell death is inhibited via downregulation of Fas expression and upregulation of p53 expression in large intestinal adenocarcinoma, and a so-called "Fas resistance" mechanism is induced.

Key Words: N/A
0 引言

肿瘤细胞可能通过表达Fas配体(FasL)攻击T细胞, 产生免疫逃逸, 国内外对该方面进行了许多研究[1-19]. 本研究采用原位杂交、免疫组化及TUNEL等技术, 观察Fas mRNA, p53 蛋白及细胞凋亡在大肠肿瘤及癌前病变中的表达, 探索大肠癌发生发展中"Fas抵抗"机制的可能作用.

1 材料和方法
1.1 材料

天津医科大学总医院1988-01/1995-02手术切除, 石蜡包埋的大肠腺癌组织37例, 腺瘤恶变组织26例, 管状绒毛状腺瘤30例, 管状腺瘤24例, 并以同期非肿瘤大肠黏膜组织蜡块6例作为正常对照组. 4 mm厚连续切片备用, 载玻片涂布APES胶以防脱片. Fas原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司. 鼠抗p53蛋白(1:500稀释, 克隆号DO-1)购自Santa Cruz Biotechnology公司, 二抗、三抗为Vector公司ABC试剂盒. 凋亡试剂盒购自德国宝灵曼公司.

1.2 方法

常规脱蜡至水, 30 mL/L H2O2室温处理10 min, 蒸馏水洗; 滴加30 mL/L柠檬酸新鲜配制的胃蛋白酶, 37 ℃消化15 min, 0.5 mol/L PBS洗5 min 3次, 蒸馏水洗1次; 每张切片约加原位杂交液20 mL, 将原位杂交专用盖玻片盖在切片上, 37 ℃杂交过夜后洗涤, 35 ℃左右, 2×ssc洗5 min×5次;滴加封闭液, 37 ℃, 30 min, 甩去多余液体, 滴加兔抗地高辛, 37 ℃, 60 min, 0.5 mol/L PBS洗2 min×3次; 滴加生物素化羊抗兔IgG, 37 ℃, 20 min, 0.5 mol/L PBS洗2 min×3次, 滴加SABC, 37℃, 20 min, 0.5 mol/L PBS洗5 min×4次; DAB显色, 15 min, 水洗; Mayer苏木素复染细胞核, 水洗, 脱水, 透明, 封固. 免疫组化ABC法常规检测大肠上皮恶性转化不同阶段组织中p53蛋白的表达. 以TUNEL法检测大肠上皮恶性转化不同阶段细胞凋亡状况, 切片以160目镜测微网在400倍放大下(面积为0.1 024 mm2)为单位面积, 计数网格中的阳性细胞数, 每组每例计数10个网格, 取其均值作为该例病变的阳性细胞密度.

统计学处理 各组阳性细胞密度间比较及指标相关性以SPSS软件行方差分析, 组间两两比较及相关系数进行处理.

2 结果
2.1 Fas mRNA阳性细胞密度(表1)
表1 大肠上皮恶性转化不同阶段Fas mRNA, p53蛋白阳性表达和凋亡细胞密度(mean±SD/0.1 024 mm2).
分组Fas mRNA阳性
p53蛋白阳性
凋亡细胞
n密度n密度n密度
非肿瘤黏膜539.60±6.51bd68.40±2.67fh615.02±11.14
管状腺瘤2250.93±21.64bd2313.19±8.95fh2446.31±18.86jl
管状绒毛状腺瘤2945.91±24.15bd3013.50±7.29fh3029.43±16.66j
腺瘤非恶变区2425.47±14.76bd2312.24±7.16fh2368.42±19.61jl
腺瘤恶变区2411.92±9.47b2373.31±28.572322.01±12.07
腺癌355.88±5.103780.99±44.543718.64±12.88
bP <0.01 vs 腺癌,
dP <0.001 vs 腺瘤恶变区,
fP <0.001 vs 腺癌,
hP <0.001 vs 腺瘤恶变区,
jP<0.01 vs 腺癌,
lP <0.001 vs 腺瘤恶变区.

腺癌分别与非肿瘤黏膜, 管状腺瘤, 管状绒毛状腺瘤, 腺瘤非恶变区(P均<0.001)及腺瘤恶变区(P = 0.003), 腺瘤恶变区分别与非肿瘤黏膜, 管状腺瘤, 管状绒毛状腺瘤及腺瘤非恶变区(P均<0.001), 腺瘤非恶变区分别与非肿瘤黏膜(P = 0.04), 管状腺瘤, 及管状绒毛状腺瘤(P均<0.001)Fas mRNA阳性表达细胞密度之间差别有统计学意义. 余对比组间比较差别均无统计学意义. 正常非肿瘤黏膜Fas mRNA表达量中等, 良性腺瘤有轻微上升趋势, 在腺瘤非恶变区则有下降趋势, 在恶性病变中明显下降, 与腺瘤非恶变区有显著差异, 以腺癌中最低, 其与腺瘤恶变区差异亦有统计学意义(图 1A, B).

2.2 p53蛋白阳性表达细胞密度与Fas mRNA表达的关系

大肠腺癌分别与非肿瘤黏膜, 管状腺瘤, 管状绒毛状腺瘤, 及腺瘤非恶变区(P均<0.001), 腺瘤恶变区分别与非肿瘤黏膜, 管状腺瘤, 管状绒毛状腺瘤, 及腺瘤非恶变区(P均<0.001)p53蛋白阳性表达细胞密度之间差别有统计学意义(表1). 余对比组间比较差别均无统计学意义. p53 蛋白阳性细胞密度以非肿瘤黏膜中最低, 良性腺瘤中稍有增加, 在恶性病变中明显增高, 以腺癌中阳性表达细胞密度最高(图1C), 但与腺瘤恶变区差异无统计学意义(P = 0.784). 大肠不同病变中, p53蛋白阳性细胞有逐渐升高趋势, 而Fas mRNA阳性表达细胞密度呈略升高后明显下降. p53呈高水平表达, 而Fas mRNA呈低表达, 二者间呈负相关(r = -0.573, P <0.001).

图1
图1 大肠上皮不同病变中Fas mRNA, p53蛋白表达阳性细胞及凋亡细胞分布特点. A:管状腺瘤中Fas mRNA表达细胞密度轻度上升×100; B:腺癌中Fas mRNA表达细胞密度降低 ×100; C: 腺癌中p53蛋白表达阳性细胞密度显著增高 ×100; D: 管状腺瘤中凋亡细胞密度增高 TUNEL ×200.

2.3 大肠不同病变中上皮凋亡细胞与p53蛋白阳性细胞及Fas mRNA阳性细胞密度的关系 大肠腺癌分别与管状腺瘤(P <0.001), 管状绒毛状腺瘤(P = 0.002), 及腺瘤非恶变区(P <0.001), 腺瘤非恶变区分别与非肿瘤黏膜, 管状腺瘤及管状绒毛状腺瘤(P均<0.001), 腺瘤恶变区分别与管状腺瘤, 及腺瘤非恶变区(P均<0.001), 管状绒毛状腺瘤分别与管状腺瘤(P <0.003)及非肿瘤黏膜(P = 0.02), 管状腺瘤与非肿瘤黏膜(P <0.001)上皮凋亡细胞密度之间差别有统计学意义(表1). 余对比组之间比较差别均无统计学意义. 良性腺瘤中上皮凋亡细胞密度较高, 腺瘤非恶变区达高峰, 增加显著, 以非肿瘤黏膜最低, 在腺瘤-腺瘤恶变-腺癌过程中有逐渐下降趋势. 非肿瘤黏膜中p53蛋白阳性表达细胞密度与上皮细胞密度均呈最低水平, 良性腺瘤中p53蛋白阳性表达细胞密度稍增加, 但仍呈较低水平, 而上皮凋亡细胞密度则显著增加, 恶性病变中p53蛋白阳性表达细胞密度与上皮凋亡细胞密度对比明显, p53蛋白呈高水平表达而上皮凋亡则呈低水平. 二者间呈负相关(r = -0.389, P <0.001). Fas mRNA在非肿瘤黏膜中呈中等水平表达, 上皮凋亡细胞密度则最低. Fas mRNA阳性细胞密度在良性腺瘤中略有增加, 而上皮凋亡细胞密度显著增高(图1D), 在腺瘤非恶变区Fas mRNA阳性表达细胞密度与上皮凋亡细胞密度似不成比例, 但在恶性病变中, 随着Fas mRNA阳性表达细胞密度显著下降, 上皮凋亡细胞密度亦有明显下降趋势, 二者呈正相关(r = 0.190, P <0.05).

3 讨论

肿瘤细胞抵抗Fas介导的凋亡是Fas反击的重要前提条件[20-21]. 否则, 同一癌细胞表达Fas及FasL会发生自分泌性"自杀", 相邻癌细胞分别表达FasL和Fas则会发生旁分泌性"互相残杀". Fas介导凋亡的抑制可能涉及细胞内信号转导的多个层面的异常[22-23]. 多种癌基因和抑癌基因的突变可影响Fas的表达及其死亡信号的转导功能, 亦可造成Fas抵抗. 有证据表明c-myc突变性上调能促成Fas抵抗, 从而保护肿瘤避免凋亡, 因此有利于增生.

我们探讨了大肠不同病变中Fas表达. 在大肠不同病变中, Fas mRNA表达有轻度上升后明显下调的趋势, 以恶性病变中显著减低, 提示Fas抵抗确存在于大肠恶性病变中, 而且主要是通过Fas下调及缺失来实现的, 但鉴于Fas可存在显性负性突变, 因此可以认为阳性表达者仍有一部分为无功能性Fas, 不足以传递死亡信号. 我们还观察了p53 蛋白在大肠上皮恶性转化进程中的表达状况[24-26]. 鉴于免疫组化法检测到的p53 均为突变型p53, 结合野生型p53 能转录上调Fas表达, 诱导凋亡的概念[27], 我们初步探讨了p53蛋白在Fas抵抗中的意义. p53突变能损害Fas死亡信号的传递, 从而妨碍凋亡, 造成Fas抵抗. 本组恶性病变中p53 蛋白表达显著增加, 与其相对的是Fas mRNA显著下调及上皮凋亡明显减少, 基本符合上述观点. 腺瘤中Fas轻微上调, 可能与p53蛋白活性有关, 但必然还会与其他基因的表达有关[28-30]. 大肠癌发生中Fas抵抗的形成可能与以上提及的多种机制有关.

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