研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1711-1714
在线出版日期: 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1711
基因表达谱芯片筛选双环醇作用HepG2细胞后的差异表达基因
王建军, 成军, 刘妍, 杨倩, 纪冬, 党晓燕, 王春花
王建军, 成军, 刘妍, 杨倩, 纪冬, 党晓燕, 王春花, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C030114020, No. C30070689, No.C39970674, No. C39900130; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-03-15
修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15

目的: 应用基因表达谱芯片技术了解双环醇在肝细胞中可能上调或下调的基因, 了解其可能的调节功能线索.

方法: 以双环醇处理HepG2细胞, 同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照; 24 h后制备细胞裂解液, 提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: 经基因表达谱芯片分析, 12种基因的表达水平上调, 9种基因的表达水平下调.

结论: 筛选到的一些与细胞周期、蛋白质的翻译合成、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的起重要作用及肿瘤发生相关的基因, 推测了双环醇可能存在的调控机制的线索, 尚需进一步的实验证明.

关键词: N/A
引文著录: 王建军, 成军, 刘妍, 杨倩, 纪冬, 党晓燕, 王春花. 基因表达谱芯片筛选双环醇作用HepG2细胞后的差异表达基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1711-1714
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 15, 2004
Revised: April 1, 2004
Accepted: May 11, 2004
Published online: July 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

百赛诺(双环醇片)是由中国医学科学院药物研究所研发, 北京协和药厂生产, 经国家药品监督管理局批准上市的国家一类抗肝炎化学合成新药, 是我国第一个有自主知识产权的国家一类新药. 双环醇对各种原因引起的肝损伤有明显的保护作用, 近年来广泛应用于病毒性肝炎的治疗中. 我们应用基因表达谱芯片技术, 筛选双环醇作用人肝癌细胞系HepG2细胞后差异表达基因, 并应用生物信息学(bioinformatics)技术对差异表达的基因进行分析. 双环醇作用HepG2细胞后差异表达基因的研究, 为深入了解双环醇在肝细胞内的调节作用机制提供理论依据.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝癌细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂及总RNA提取试剂Trizol均购自Gibco公司. 双环醇为二甲基硫氧化物(DMSO)水溶液. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时分别将双环醇及DMSO加入细胞培养液中, 使双环醇终浓度达到1×10-5 moL/L, 24 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL Trizol试剂. 立即于液氮中保存.

1.2 方法

1.2.1 总RNA提化及mRNA纯化: 使用Trizol试剂一步法提取双环醇及DMSO处理的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 s、18 s条带变化. 以Qiagen公司Oligotex mRNA Midi Kit纯化得mRNA. 操作按说明书进行, 并行电泳检测.

1.2.2 探针标记: 参照Schena et al[1]方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 g), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 g). 乙醇沉淀后溶解在20 L 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中.

1.2.3 芯片制备: 芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合 (2 h)、室温干燥(30 min), UV交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L 的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.4 杂交及洗涤: 将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 2 g/L SDS、1 g/L×SSC +2 g/L SDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.5 检测与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值.阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果
2.1 总RNA及mRNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.2 芯片杂交体系验证及结果分析

在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交技术体系的整个过程, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共94条, 占8.15%, 其中38条基因表达增强, 56条基因表达降低.

2.3 双环醇下调基因类型在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为双环醇的下调基因. 我们发现有9种基因的表达水平下调(表1).

表1 双环醇下调基因类型.
编号Cy5/Cy3基因名称
10.461成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)
20.463核膜层蛋白 B 受体 (LBR)
30.469DEAD/H 框蛋白
40.470鸟苷酸环化酶1 (GUCY1)
50.479丝分裂素激活蛋白激酶激酶的激酶2 (MAP3K2)
60.483磷蛋白
70.485脂酰辅酶 A氧化酶
80.489内皮素1 (EDN1)
90.498RNA结合性基序蛋白 (RBM)
2.4 双环醇上调基因

双环醇上调基因类型在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.00以上, 就判断为双环醇的上调基因. 我们发现有12种基因的表达水平上调(表2).

表2 双环醇上调基因类型.
编号Cy5/Cy3比值基因名称
12.005B-细胞 CLL/淋巴瘤 10 (BCL10)
22.021FYN-结合蛋白(FYB)
32.025乳酸脱氢酶 B,
42.039FKBP-相关蛋白(FAP48),
52.084细胞分裂周期蛋白23 (CDC23)
62.591甘氨酸脒基转移酶(GATM)
72.092白血病抑制因子受体(LIFR)
82.106二乙基对硝基苯磷酸酯酶2
92.210DnaJ样热激蛋白 40 (HLJ1)
102.360肿瘤坏死因子受体(TNFR)
112.456Cofilin蛋白
122.484CAMP依赖性蛋白激酶
3 讨论

百赛诺(双环醇片)对于肝细胞损伤具有保护作用[1-3]. 对慢性丙型肝炎有很好的改善临床症状和降低转氨酶的作用, 长期服用, 无明显不良反应, 耐受性好[4]. 此外, 双环醇还对肾缺血-再灌注损伤有保护作用[5]. 基因表达谱芯片技术可快速有效地检测到两组组织或细胞基因表达谱的差异.我们分别应用双环醇及其溶剂DMSO处理HepG2细胞, 使双环醇终浓度达到1×10-5 moL/L, 24 h后收获细胞, 之后从中提取总RNA, 逆转录为cDNA, 进行基因芯片技术分析. 结果表明, 12种基因的表达水平上调, 9种基因的表达水平下调, 在下调的基因中, 包括一些蛋白质体内合成、肿瘤发生、脂类代谢及信号传导相关的基因. 核膜层蛋白 B 受体(LBR)、 RNA结合性基序蛋白(RBM)、DEAD/H 框蛋白参与细胞核的转录、复制、翻译等生物学功能. 内皮素1 (EDN1)为强有力的血管收缩剂, 还具有多种生物学效应, 包括血液动力学、心肌、肾脏、内分泌、平滑肌收缩和促细胞分裂效应等. 也调节基因表达和培养的血管和非血管细胞的生长. 可能参与体内微管结构的生长和补偿性改造. 其对细胞核信号的传递可能在细胞分化和发育中起关键作用[6-10]. 成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)由一些T细胞产生, 并对这些T细胞起到刺激作用. 这些受体使T细胞响应在损伤和炎症刺激后成纤维细胞生长因子的表达. 并且与T细胞受体有相互作用[11]. 与前列腺癌的进展相关[12], 还有人认为其水平的增高为癌前病变的指标[13]. 介导富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白对内皮细胞增生和骨骼成肌细胞分化的抑制作用[14]. 与碱性成纤维细胞生长因子有高亲和性, 通过阻断FGFR1相关的血管发生,可能对抑制肿瘤的生长具有一定的作用[15]. 鸟苷酸环化酶1 (GUCY1)为催化cGMP合成的酶, 直接或间接对各式各样的刺激进行应答, 包括激素和神经递质[16-19]. 丝分裂素激活蛋白激酶激酶的激酶2(MAP3K2)是MAP激酶家族成员, 参与细胞内信号转导途径. 脂酰辅酶 A氧化酶参与脂肪酸的氧化, 与脂类代谢相关.

在上调的基因中, 包括一些与细胞周期、凋亡、能量代谢及免疫相关的基因. 细胞分裂周期蛋白23(CDC23): 与细胞的染色质相关, 将细胞增生和DNA的复制之间联系起来, 通过刺激微染色体复合物的磷酸化作用参与细胞分裂周期前复合物的活化作用, 在DNA复制的起始阶段起重要作用[20-22]. Cofilin蛋白是人T细胞中的一种胞质磷蛋白, 是一种小分子的肌动蛋白结合蛋白, 受辅助刺激信号的调节, 去磷酸化后易位至细胞核.DnaJ样热激蛋白40 (HLJ1)为一种伴侣蛋白, 多在心脏、骨骼肌和胰腺中表达[23]. 甘氨酸脒基转移酶(GATM) 、乳酸脱氢酶 B在肌酸和糖类代谢中起重要作用. 白血病抑制因子受体(LIFR)为体内免疫抑制因子的受体. BCL10: 为细胞内的一种蛋白成分, 与细胞凋亡相关, 对核因子B(NF-κB)的激活有重要作用, 在许多淋巴瘤和实体肿瘤中均发现其基因的突变或缺失, 因此推测其缺失或突变可能为这些肿瘤发生的基因基础[24-26]. FAP48是细胞内与免疫调节有密切关系的蛋白类型[27].这种蛋白与肽基脯氨酰异构酶、FK506结合蛋白59(FKBP59)和FKBP12蛋白之间能够结合, 具有大环内酯类分子的结合位点, 可能是这些免疫抑制剂药物受体的天然的共同配体分子[28-29]. FYN-结合蛋白(FYB): 可上调整合素蛋白介导的细胞黏附功能和肥大细胞内炎性递质的释放, 参与炎症和变态反应的过程[30]. 二乙基对硝基苯磷酸酯酶2: 为一种酯酶, 与HDL相关, 可降低LDL脂质过氧化的敏感性[31]. 在氧化应激作用下可表达增加, 起到抗氧化酶的作用减轻氧化损伤并减弱巨噬细胞泡沫结构的形成[32-33]. CAMP依赖性蛋白激酶(CPKA)参与调节体内多种蛋白的功能, 具有抑制凋亡[34]、 提高细胞的活动力[35]、提高自然杀伤(NK)细胞的细胞毒作用[36]、 调节丘脑后部加压素的表达[37]、抑制细胞外信号调节激酶(Erk)和p38丝分裂素蛋白激酶(MAPK)的活性等作用.

通过对上述双环醇激活相关基因的分析, 我们发现应用双环醇刺激细胞后, 一些与与细胞周期、蛋白质的生物合成、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的起重要作用及肿瘤发生相关的基因表达增高或降低, 提示双环醇在维持细胞稳定、促进损伤细胞修复及提高机体免疫力, 抗肿瘤方面可能有一定作用. 关于双环醇具体的体内作用机制仍需要进一步的实验来证实.

编辑: N/A

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