修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15
目的: 应用基因芯片技术, 检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响, 进一步NS3TP1蛋白可能的分子生物学功能.
方法: 设计并合成NS3TP1基因序列特异性的引物, 应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段, 以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP1. 以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.
结果: 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定, 证实准确无误, 提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA, 进行DNA芯片技术分析. 在1 152个基因表达谱的筛选中, 发现有26个基因表达水平显著上调, 14个基因表达水平显著下调.
结论: 应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TP1转染细胞后差异表达基因, 为进一步阐明NS3TP1蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据.
引文著录: 纪冬, 成军, 刘妍, 王建军, 郭江. 应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1707-1711
Revised: April 1, 2004
Accepted: May 11, 2004
Published online: July 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(7): 1707-1711
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i7/1707.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i7.1707
丙型肝炎病毒(HCV)是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒, 在大多数感染人群中表现为持续感染, 常导致急慢性肝炎、肝硬化和肝癌[1-10]. 虽然HCV致病机制尚不完全清楚, 但病毒基因组编码的蛋白与肝细胞蛋白之间的相互作用肯定起着关键的作用. HCV基因组具有一个长约9 400 bp的单一开放读码框(ORF), 编码一个多肽前体, 在病毒及肝细胞酶的作用下进行剪切, 产生至少10种具有不同功能的蛋白. 其中HCV非结构蛋白3(NS3)具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶(NTPase)和解旋酶(helicase)的功能, 在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用, 并且对于宿主多种基因具有反式激活作用, 影响细胞的功能, 诸如细胞增生、凋亡, 甚至是HCV的致癌作用[11-15]. 我们对NS3反式激活基因进行筛选和克隆化研究[16-19], 发现了NS3蛋白上调一些基因的表达, 并且包括一些未知功能基因, 其中之一命名为NS3TP1, 利用生物信息学技术确定其ORF, 并对其进行了克隆化研究, 顺利得到了NS3TP1基因编码序列, 该新基因的ORF长度为1 932个核苷酸(nt), 编码产物由642个氨基酸残基(aa)组成(GenBank号: AY116969)[20].
为了探索NS3TP1的生物学功能, 深入了解HCV NS3蛋白的反式激活作用, 我们构建了NS3TP1基因的真核表达载体, 应用基因表达谱芯片技术[21], 筛选NS3TP1基因转染细胞后差异表达的基因, 检测NS3TP1蛋白的表达对肝细胞基因表达谱的影响, 推测其在体内可能存在功能的线索, 为研究HCV的致病机制及探索新基因的功能提供了新的方向.
HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5由本室保存; pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司; FuGENE6转染试剂购自Roche公司; mRNA Purification试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司; PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix, Advantage PCR Cloning试剂盒均购自Clontech公司; T7, SP6通用引物及pGEM-Teasy载体购自Promega. 人类基因组分类I芯片包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、细胞信号转导相关基因等1 152个cDNA, 由上海联合基因有限公司提供.
1.2.1 真核表达载体及细胞转染: 设计合成NS3TP1基因序列特异性引物(上游: 5'- GAT ATC AAT GTG TGG CAT TTG TTG -3' 下游: 5'-GGA TCC TGT TAC ATT GTG AAT CAC -3', 在引物的两端分别引入了EcoR V和BamH I酶切位点(划线部分), 引物由上海博亚公司合成. 使用25 L反应体系, 以HepG2细胞cDNA为模板, 放入PE 9600 PCR 仪中扩增. 扩增条件: 94 ℃变性50 s, 60 ℃退火50 s, 72 ℃延伸60 s , 循环35次后, 72 ℃保温10 min. 9 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果. 扩增的NS3TP1蛋白编码基因首先克隆到TA载体中进行序列测定, 然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP1. 用FuGENE6转染试剂将2 g pcDNA3.1(-)-NS3TP1及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.
1.2.2 芯片制备: 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了NS3TP1表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析. 逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 g), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 g).乙醇沉淀后溶解在20 L 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中. 包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用2 g/L SDS, 水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用. 将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 2 g/L SDS, 0.1×SSC +2 g/L SDS, 0.1×SSC洗涤10 min, 室温晾干. 用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene 3.0软件分析Cy3, Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3＞2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3＜0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.
真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1经过限制性内切酶分析和核苷酸序列的测定, 证实含有完整的开放读码框, 序列准确无误.
实验组和对照组总RNA的吸光度A260/A280分别为2.045和1.995, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.
在芯片上共有1 152个cDNA, 为了监控芯片杂交技术体系的整个过程, 在芯片上设置阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 在这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性.由于实验组探针标记Cy5荧光素呈红色, 对照组探针标记Cy3荧光素呈绿色, 红绿色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平的差异, 黄色代表表达水平无差异.按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共40条, 其中26条基因表达增强(表1), 14条基因表达降低(表2).
| 编号 | Cy3/Cy5 | 基因名称 |
| 1 | 2.009 | KIAA0009 gene product |
| 2 | 2.012 | 肿瘤差异表达1(TDE1) |
| 3 | 2.057 | 泛素特异性蛋白酶1(USP1) |
| 4 | 2.064 | 甘氨酸脒基转移酶(GATT) |
| 5 | 2.080 | cAMP应答元件结合蛋白CRE-BPa |
| 6 | 2.093 | cullin 2 (CUL2) |
| 7 | 2.104 | 早老因子2(阿尔茨海默病4) (PSEN2) |
| 8 | 2.121 | 胱冬肽酶6(caspase 6) |
| 9 | 2.131 | 组织蛋白酶K(CTSK) |
| 10 | 2.149 | 维生素A反应性细胞骨架相关蛋白(JWA) |
| 11 | 2.195 | FYN结合蛋白(FYB) |
| 12 | 2.210 | TRAIL受体2 |
| 13 | 2.215 | 可溶性鸟苷酸环化酶3(GUCY1B3) |
| 14 | 2.262 | 乳酸脱氢酶B |
| 15 | 2.263 | M期磷蛋白(MPHOSPH1) |
| 16 | 2.268 | 转化生长因子(TGF)受体1(TGF-RI) |
| 17 | 2.360 | SMAP-3蛋白 |
| 18 | 2.371 | 固醇-C5-脱氢酶 |
| 19 | 2.402 | 谷氨酸盐受体 |
| 20 | 2.411 | [角]鲨烯环氧酶(SQLE) |
| 21 | 2.428 | FKBP相关蛋白(FAP48) |
| 22 | 2.528 | 转录因子7(T-细胞特异性, HMG盒) (TCF7) |
| 23 | 2.537 | B-细胞慢性淋巴细胞性白血病10(BCL10) |
| 24 | 2.263 | CD24抗原(小细胞肺癌簇4抗原) |
| 25 | 2.923 | 胆囊收缩素型-A受体 |
| 26 | 3.129 | cAMP依赖的蛋白激酶(PRKAR2B) |
| 编号 | Cy3/Cy5 | 基因名称 |
| 1 | 0.367 | 金属蛋白酶的组织抑制因子1 |
| 2 | 0.426 | 金属硫蛋白1G(MT1G) |
| 3 | 0.431 | 免疫球蛋白(CD79A)结合蛋白1 (IGBP1) |
| 4 | 0.444 | 调钙蛋白的结合蛋白质1(CALD1) |
| 5 | 0.453 | RNA结合蛋白S1, 丝氨酸富含结构域(RNPS1) |
| 6 | 0.455 | RAC1配体(POR1) |
| 7 | 0.459 | RAS同源基因家族成员C (ARHC) |
| 8 | 0.464 | DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)盒蛋白(DDX21) |
| 9 | 0.465 | KIAA0943蛋白 |
| 10 | 0.471 | SUMO-1激活酶亚单位1(SAE1) |
| 11 | 0.486 | 突触素样蛋白(SYPL) |
| 12 | 0.490 | 谷胱甘肽S-转移酶M3(GSTM3) |
| 13 | 0.498 | 精氨基琥珀酸盐合成酶(ASS) |
| 14 | 0.499 | G蛋白途径抑制子1(GPS1) |
HCV NS3不仅和病毒复制和成熟相关, 而且他可以反式激活宿主细胞内多种基因表达, 从对肝细胞的生长、代谢、甚至是恶性转化产生重要影响, 尽管在HCV蛋白尤其是NS3的结构、功能上积累了很多数据, 可是关于他们在细胞内的靶位及影响却知之甚少, 还处在一个逐渐摸索的阶段. 前一阶段, 我们运用抑制性消减杂交技术构建出HCV NS3反式激活基因差异表达的cDNA消减文库, 并发现了一些新基因[22-23], 其中一个命名为NS3TP1, 对其进行克隆化研究, 为深入研究NS3蛋白的生物学功能迈出了可喜的一步. 对于一个新蛋白来说, 由于以往对其没有认识, 需要对他的表达调控、翻译后修饰、生物功能以及相互作用等方面进行研究, 这是一项有挑战性的工作, 这种思路有望对HCV感染的诊断、预后及疗效判断等提出新的参考. 为进一步研究NS3TP1这一新基因的功能, 明确HCV NS3在丙型肝炎发病机制中的作用, 我们构建NS3TP1基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP1, 利用基因芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因, 推测其在体内可能存在功能的线索. 结果表明, 26种基因的表达水平显著上调, 14种基因的表达水平显著下调. 这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导、免疫调节、肿瘤发生等基因, 使得对NS3TP1蛋白在机内的作用有了更进一步的了解, 对NS3蛋白功能和复杂性、多样性也有了更加深刻的体会.
分析上调基因, cAMP应答元件结合蛋白CRE-BPa是CRE-BP1家族的新成员, 含有推定的金属指状结构和由碱性氨基酸簇和亮氨酸拉链组成的DNA结合功能域, CRE-BPa能特异性的与CRE结合形成同源二聚体, 与转录因子c-JUN或CRE-BP1结合成异源二聚体, 是CRE依赖的转录反式激活因子[24]. 转化生长因子受体I(TGF-RI)是丝氨酸/苏氨酸激酶膜受体家族的成员, TGF-RI激酶过表达, 能促进多种信号传导途径的激活, 对于肿瘤细胞的迁移, 以及重要的致瘤事件如Smad2/Smad3的磷酸化是必需的[25-26]. B淋巴细胞表面的分化抗原CD24是B细胞表面的信号转导分子, 能够调节多种信号活化的应答, 能诱导B淋巴细胞凋亡, 下游信号分子是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及细胞外信号调节激酶1(ERK1)的活化[27-29]. 研究还发现, CD24抗原是肝细胞癌细胞中高度表达的基因, 与p53基因突变及肿瘤分化高度相关, CD24抗原是潜在的肝细胞肿瘤早期标志基因[30]. B细胞慢性淋巴细胞性白血病10(BCL10)是作为低度B细胞淋巴瘤相关基因得到鉴定的, 是一种含有胱冬肽酶募集结构域(caspase recruitment domain, CARD)的蛋白, 同时属于黏膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissud, MALT)B淋巴瘤中鉴定的断裂位点的基因, 在淋巴细胞中抗原受体介导的NF-κB激活过程中是必需的. BCL10是一种介导细胞凋亡信号转导的因子, 主要的分子机制就是通过不同的磷酸化修饰, 与cIAP结合替代与TRAF2结合[31-35]. FKBP相关蛋白(FAP48)是细胞内与免疫调节有密切关系的蛋白, 可以与肽基脯氨酰异构酶FK506结合蛋白59(FK506-binding protein 59, FKBP59)和FKBP12蛋白结合, 由于其Mr 48 000, 故命名为FKBP相关蛋白(FAP48), 此3种蛋白均具有大环内酯类分子的结合位点, 可能是这些免疫抑制剂药物受体的天然的共同配体分子. FAP48与FKBP分子之间的结合可被大环内酯类物FK506所阻断, 说明免疫亲和素分子中的结合位点与FK506的结合位点相重叠. FAP48的过表达可以抑制细胞的增生, 在免疫调节及临床疾病的发生、发展过程中具有十分重要的作用[36-40]. 我室应用基因芯片研究HBV截短型表面抗原中蛋白(MHBst)、HBxAg、HCV NS3等反式激活蛋白的调节基因时, 均发现FAP48可以明显上调, 与本实验一起, 提示了肝炎病毒蛋白与细胞内FAP48蛋白的表达水平密切相关, 可能是HBV、HCV感染慢性的重要机制之一[41-43].
在下调基因中, 钙调素结合蛋白1(CALD1)、金属硫蛋白1G(MT1G)、金属蛋白酶的组织抑制因子1等与体内金属代谢有关. DEAD/H盒蛋白DDX21是推定的重要的RNA解旋酶, 参与众多细胞的RNA二级结构加工过程, 如翻译起始、核糖体RNA合成及加工过程, DDX21在肿瘤组织中低表达, 而在正常组织中有显著的高水平表达, NS3TP1对DDX21的表达有下调作用, 提示NS3TP1蛋白在一定程度上可能下调细胞核糖体RNA加工与合成[44].
随着后基因组时代的到来, 越来越多的未知功能蛋白质被发现, 对新蛋白的生物学功能、与其他蛋白质间的相互作用以及他们在疾病发生、发展、转化过程中的变化规律的研究成为今天生命科学最重要的热点之一, 同时由于新技术的不断创新, 使一系列的研究成为可能[45]. 利用基因表达谱芯片能进行大规模筛选的优点, 我们从1 152中基因中筛选出NS3TP1基因转染细胞差异表达的基因, 基于上述结果的提示, 使我们可以设计相应的实验去进行更深入的研究, 为更加全面地了解新基因NS3TP1的功能作铺垫, 也为更多新基因功能研究工作积累了经验.
编辑: N/A
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