修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15
目的: 丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白是一个新的HCV基因产物, 其生物学特性目前尚不明确, 我们应用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选F蛋白结合蛋白基因.
方法: 构建F蛋白诱饵质粒, 转化酵母AH109后与含肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合, 在涂有X--gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长. 挑选蓝色克隆, 提取此酵母克隆的质粒, 转化大肠杆菌提取质粒DNA后测序, 进行生物信息学分析.
结果: 筛选出36个与F蛋白特异性相互作用的克隆, 其中11个为人类酶原颗粒蛋白, 5个锌指蛋白, 6个SL15蛋白, 2个过氧化物酶体离子蛋白酶, 1个补体调节蛋白因子, 2未知功能基因.
结论: 克隆到的基因对以后研究F蛋白的功能有一定提示作用.
引文著录: 黄燕萍, 成军, 王琳, 杨倩, 杨瑗, 白桂芹, 刘敏, 张树林. 酵母双杂交技术筛选HCV F蛋白结合蛋白基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1701-1704
Revised: April 1, 2004
Accepted: May 11, 2004
Published online: July 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(7): 1701-1704
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i7/1701.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i7.1701
丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒科, 基因组为单股正链RNA, 长度约为9.6千碱基对(kb), 编码一个约3 010个氨基酸残基(aa)组成的多蛋白, 在病毒和宿主细胞蛋白酶的共同裂解作用下, 至少切割产生10个病毒基因编码产物: C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B. F蛋白是HCV基因组RNA核心蛋白编码序列表达的一个17 ku蛋白, 与核心蛋白有一个重叠的编码序列(5-485 nt)[1-3], 其生物学功能尚不明确.我们通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库, 寻找可与F蛋白相互作用的蛋白, 为揭示F蛋白潜在的生物学功能提供依据[4-5].
Saccharomyces cerevisiae AH109酵母株、Y187酵母株(K1612-1)、预转化入酵母的对照质粒pGBKT7-53(AH109)、编码DNA-BD/鼠p53融合蛋白、pTD1-1(Y187)、质粒pACT2中编码AD/SV40大T抗原融合蛋白、预转化的cDNA肝文库(Y187)、质粒pACT2表达AD/cDNA文库融合蛋白(PT3183-1), pGBKT7-BD克隆载体、pGADT7-AD克隆载体、pGBKT7-53对照质粒、pGBKT7-Lam对照质粒, 酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基、SD/-Leu培养基、SD/-Trp/-Leu培养基、SD/-Trp/-Leu/-His培养基、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基、X--半乳糖苷酶(Gal)等均购自Clontech公司; 半硫酸腺苷、醋酸锂购自Sigma公司.
1.2.1 诱饵质粒载体的构建及酵母配合实验: F蛋白的酵母表达载体pGBKT7-F由本室构建, 用醋酸锂法[6]转入酵母细胞AH109后, 在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上培养, 无集落生长, 排除其自身激活作用. 挑取在SD/-Trp培养基上的转化子, 即pGBKT7-F(AH109, 基数大于1×1012细胞/L), 与肝细胞cDNA文库混合, 30 ℃轻摇配合过夜, 24 h后铺板SD/-Trp/-Leu/-His25块、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade25块. 同时进行阳性对照实验及文库滴定. 生长12-16 d后把长出的大于2 mm的酵母集落, 在铺有X--半乳糖苷酶的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上检查-半乳糖苷酶活性, 认为在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上生长且出现蓝色菌落的配合为阳性集落.
1.2.2 阳性质粒的克隆和分析: 挑取真正的阳性集落按照试剂盒提供的Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠杆菌, 与含有氨苄青酶素的SOB平板培养, 所获得的菌落酶切鉴定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank比对, 进行生物信息学分析.
因质粒pACT2内含有2个BglⅡ酶切位点, 分别位于多克隆位点两侧, 故使用该内切酶消化将释放出所筛选到的肝细胞文库的基因片断(图1). 中出现的各个大小不同的DNA片断证实我们筛选的克隆为阳性克隆, 而非配合后在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基生长的假阳性克隆.
挑选36个克隆测序, 与GenBank数据库进行比较. 36个克隆中有35个均与已知基因的部分序列高度同源(97-100%), 这些已知基因包括人类酶原颗粒蛋白、人类SL15蛋白、人类锌指蛋白83、人类锌, 2-糖蛋白1、人类过氧化物酶体离子蛋白酶、人类补体调节蛋白因子1、人类血管紧张素原、人类唾液酸转移酶、人类丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂、人类组织蛋白酶和人类玻璃体结合蛋白等共11种, 2个为未知功能基因(表1).
| 序号 | 已知的同源序列编码蛋白 | 相同克隆数 | 同源性(%) |
| 1 | 人类酶原颗粒蛋白16 | 11 | 99 |
| 2 | 人类SL15蛋白 | 6 | 99-100 |
| 3 | 人类锌指蛋白83 | 5 | 100 |
| 4 | 人类锌α2-糖蛋白1 | 4 | 99 |
| 5 | 人类过氧化物酶体离子蛋白酶 | 2 | 100 |
| 6 | 人类补体调节蛋白因子1 | 1 | 98 |
| 7 | 人类血管紧张素原(丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂,clade A-α1抗蛋白酶,α1-抗胰蛋白酶) | 1 | 97 |
| 8 | 人类唾液酸转移酶(β半乳糖苷酶α-2,6唾液酸转移酶) | 1 | 97 |
| 9 | 人类C1抑制剂,丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂 | 1 | 99 |
| 10 | 人类组织蛋白酶B | 1 | 99 |
| 11 | 人类玻璃体结合蛋白(血清传播因子,促生长因子) | 1 | 100 |
| 12 | 人类未知基因 | 2 | 98-99 |
丙型肝炎病毒是输血后肝炎主要的病原体, 常导致严重肝病, 包括肝硬化和肝细胞癌. 由于缺乏有效的体外复制系统和适当的HCV感染的动物模型, 阻碍了其有关发病机制、病毒复制以及防治策略的研究. HCV核心蛋白构成了病毒的核衣壳成分, 同时也是重要的调节因子, 大量证据表明核心蛋白可以直接调节细胞内信号传导、参与宿主的免疫应答、影响细胞凋亡信号, 反式调节病毒及细胞内的一些基因的转录和干扰脂类代谢, 其分子机制之一就是病毒与宿主蛋白质之间的相互作用[7-18]. F蛋白是一个新的HCV基因产物[1-3]. 编码F蛋白的开放阅读框与核心蛋白的编码序列重叠, 是翻译过程中核糖体阅读框发生-2/+1位漂移产生的, 与核心蛋白具有相同的N-端序列. F蛋白与核心蛋白、NS5A相似, 亚细胞定位于内质网[19-22], 但显示比核心蛋白有更多的序列差异性, 核心蛋白的突变导致患者逃避宿主免疫反应, 可能触发了细胞的恶性转化. 核心蛋白的某些功能是否是F蛋白的作用, F蛋白对病毒的侵入、是否调控HCV RNA的复制, 是否参与病毒的形态形成及在病毒生命周期中调节细胞功能是否发挥重要作用, 值得进一步研究.
病毒蛋白与肝细胞蛋白之间相互作用是病毒致病的关键之一, 他们的相互作用介导病毒进入肝细胞, 他们的网络作用可改变蛋白的正常生物学功能, 影响病毒自身的复制、持续感染和致病. 酵母双杂交系统是分析真核细胞中蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的一种有效的基因分析方法, 为研究蛋白在体内生理情况下的相互作用提供了一种新的遗传学方法.酵母双杂交系统3[23-25]的原理是利用a型和型酵母配合形成二倍体细胞内诱饵质粒与文库质粒所表达的蛋白质可以相互作用, 他有三个报告基因用来筛选及严格的对照, 阳性率达到95%, 假阳性率为5%以下. 我们在实验中根据此技术构建了pGBKT7-F诱饵质粒并在酵母菌株AH109中表达了HCV F基因, 与预转化的酵母肝细胞cDNA文库进行双杂交筛选, 得到真正阳性克隆36个, 进行测序分析. 其中34个为已知基因序列, 2个未知功能基因序列.
我们筛选到了大量相同蛋白(11个相同克隆), 人类酶原颗粒蛋白16(ZG16). ZG16在胰腺细胞中大量表达, 是酶原颗粒内部表面部分膜蛋白基质的连接蛋白, 已经证明由硫酸蛋白分解素、糖蛋白和植物凝集素ZG16P组成的部分膜蛋白基质在酶原颗粒形成中对酶原限制及选择是非常重要的, ZG16影响着蛋白合成率、分泌性蛋白细胞内的转运率及酶原的成熟[26-29]. 有研究表明HCV感染和其所致的慢性肝病与糖尿病有明显的相关性[30-31], 糖耐量降低与丙型肝炎严重程度有关. 我们实验结果表明HCV F蛋白与ZG16相互作用, 为揭示HCV F蛋白的功能、HCV致病机制及与糖尿病的关系的研究提供了新的线索. 我们筛选到的另一种重要蛋白是锌2糖蛋白(ZAG). ZAG存在于精液及其他体液中, 肝细胞被认为是血浆ZAG的主要来源. 肿瘤可以诱导正常前列腺或其他分泌性上皮分泌内源性的ZAG, 前列腺癌、乳腺癌及汗腺瘤均含有ZAG. 有研究证实ZAG产物与肿瘤分化状态相关, 肿瘤ZAG产物可引起全身性的ZAG浓度增加, ZAG可诱导脂肪分解, 导致恶病质. 人和动物实验表明ZAG是前列腺癌潜在的血清标志物, ZAG表达是否可预示风险和疾病恶化[32]. 玻璃体结合蛋白. 属非胶原蛋白, 又被称为血清传播因子、S蛋白和上皮细胞移动因子, 是人类血浆和血清中的糖蛋白、粘连蛋白, 他也存在于不同的疏松结缔组织中, 特别是弹性纤维中. 玻璃体结合蛋白通过在细胞玻璃体结合蛋白特异性细胞表面受体的细胞结合域Arg-Gly-Asp (RGD)序列相互作用而结合到细胞上. 他可调节血凝固和补体诱导的细胞溶解, 结合了基质的玻璃体结合蛋白在调节细胞周围蛋白溶解起着重要作用. 玻璃体结合蛋白可促进许多正常和新生物细胞的细胞附着、传播、增生及分化[33-34]. C1抑制物(C1INH)是血清中高度糖基化的一种蛋白质, 含糖量高达35-49%. 与其他几种丝氨酸蛋白酶抑制物(serpin)超家族成员(1抗胰蛋白酶、1抗糜蛋白酶及抗凝血酶Ⅲ等)约有30%的氨基酸同源性. C1INH可与活化的C1r或C1s结合形成稳定的复合物而导致C1丝氨酸蛋白酶失活. C1INH能防止在缺乏抗体时, C1以很低但仍有一定速率出现的自发激活. C1INH还可抑制凝血因子Ⅻa、Ⅺa、激肽释放酶及纤溶酶, 因而其在凝血、激肽和纤溶系统中也有重要的调节作用[35-36].
唾液酸转移酶是糖基转移酶家族中的成员, 存在于高尔基体中, 具有催化细胞黏附分子-神经节甙酯聚唾液酸化的功能, 神经节甙酯是一类膜结合的含唾液酸的糖鞘脂, 是细胞黏附和体外培养恶性细胞生长的重要因子[37]. 近年糖鞘脂作为信号分子直接参与信号传导或通过影响其他膜蛋白的机制研究是热点, 他将促使我们对细胞识别、信号传递、神经发育进一步认识.
除此之外, HCV F还与补体调节蛋白因子1、人类过氧化物酶体离子蛋白酶、人类组织蛋白酶B及2个推定蛋白基因有相互作用. 我们筛选到的一些结合蛋白分别与糖代谢, 免疫调节, 肿瘤发生、发展等有密切关系. 这些结合蛋白的发现, 为揭示HCV F生物学功能、HCV致病机制及其恶性转化的原因提供了新的研究线索.
编辑: N/A
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