病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 851-854
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.851
应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
王建军, 纪冬, 成军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花
王建军, 纪冬, 成军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
王建军, 男, 吉林省人, 汉族, 1975-6-17生, 医师, 1999年毕业于第一军医大学, 获得医学学士学位, 现为军医进修学院内科传染病专业2001级硕士学位研究生, 主要从事传染病临床与病毒性肝炎的发病机理研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

目的: 应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization, SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库, 筛选并克隆双环醇调节相关基因, 阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.

方法: 以双环醇处理HepG2细胞, 同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照; 24 h后制备细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库. 文库扩增后得到46个白色克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1 000 bp插入片段. 挑取含有插入片段的30个克隆进行测序, 并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.

结论: 应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库. 该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.

关键词: N/A
引文著录: 王建军, 纪冬, 成军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花. 应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 851-854
Screening and cloning of genes differential expressed in HepG2 cells treated with bicyclol by suppression subtractive hybridization
Jian-Jun Wang, Dong Ji, Jun Cheng, Yan Liu, Qian Yang, Xiao-Yan Dang, Chun-Hua Wang
Jian-Jun Wang, Dong Ji, Jun Cheng, Yan Liu, Qian Yang, Xiao-Yan Dang, Chun-Hua Wang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: Grants from the National Natural Scientific Foundation, No. C03011402, No. C30070690; and the 9.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 98D063; and the Launching Foundation for Student Studying Abroad of PLA, No. 98H038; and the 10.5 Youth Research and Technique Foundation of PLA, No. 01Q138; and the 10.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

AIM: To construct a subtractive cDNA library of genes differential expressed in human hepatocarcinoma cell line HepG2 cells treated with bicyclol using suppression subtractive hybridization (SSH) technique and to clone genes associated with its regulation effects.

METHODS: The mRNA was isolated from HepG2 cells treated with bicyclol and dimathyl sulfoxide (DMSO), respectively, and then cDNA was synthesized. After restriction enzyme RsaI digestion, small sizes cDNA were obtained. Tester cDNA was subdivided into two portions and each was ligated with different cDNA adaptor. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent nested polymerase chain reaction (PCR) twice, the DNA fragment was subcloned into T/A plasmid vectors to set up the subtractive cDNA library. Amplification of the library was carried out with E. coli strain JM109. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after colony PCR.

RESULTS: The subtractive cDNA library of genes differentially expressed in HepG2 cells treated with bicyclol was constructed successfully. The amplified library contained 46 positive clones. Colony PCR showed that these clones contained 200-1 000 bp inserts. Thirty clones were analyzed by sequencing and bioinformatics. fourteen known genes were obtained.

CONCLUSION: A subtractive cDNA library of genes differential expressed in HepG2 cells treated with bicyclol using SSH technique is constructed successfully, which brings some new clues for studying the regulation mechanism of bicyclol in vivo.

Key Words: N/A
0 引言

双环醇(商品名: 百赛诺)是由中国医学科学院药物研究所研发, 北京协和药厂生产, 经国家药品监督管理局批准上市的国家一类抗肝炎化学合成新药. 该药是我国第一个有国际独立知识产权的国家一类新药. 双环醇对各种原因引起的肝损伤有明显的保护作用. 对于慢性肝炎, 双环醇对丙氨酸转氨酶(ALT)升高的患者疗效显著, 而且安全性好, 近年来广泛应用于病毒性肝炎的治疗中.虽然在临床上取得了一定的疗效, 但是起作用的分子生物学机制没有进行系统的研究. 为了阐明双环醇作用的分子生物学机制, 我们拟对双环醇作用的靶基因进行筛选. 抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)是1990年代后期建立的一种基因克隆的新技术, 可以快速有效地检测到差异表达的基因. 本项研究应用SSH技术, 构建双环醇作用于人肝癌细胞HepG2后差异表达基因的cDNA消减文库, 筛选并克隆双环醇的免疫调节基因, 并应用生物信息学(bioinformatics)技术初步获得其基因全长序列. 为深入了解双环醇病毒性肝炎的治疗过程中的作用机制提供新的理论依据.

1 材料和方法
1.1 主要试剂及载体

人肝癌细胞系HepG2细胞及大肠杆菌JM109(本室保存), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒(Clontech), 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-T载体(Promega). DNA序列测定由上海博亚公司完成.

1.2 药物处理及mRNA提取

双环醇为二甲基硫氧化物(DMSO)溶液. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时分别将双环醇及DMSO加入细胞培养液中, 使双环醇终浓度达到1×10-5 M/L, 24 h后收获细胞. 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取双环醇及DMSO处理的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计分别进行定性、定量分析.

1.3 消减杂交文库的建立

采用PCR-Select cDNA Subtraction Kit, 常规SSH方法按说明书进行: 以双环醇及DMSO处理的HepG2细胞mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA), 并分别标记为Tester和Driver, dscDNA经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的内切酶)消化, 产生相对较短的平端片段, 纯化酶切产物. 将Tester的dscDNA分为两份, 分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2, 然后与过量的Driver dscDNA进行杂交; 合并两种杂交产物后再与Driver dscDNA作第2次杂交; 然后将杂交产物做选择性PCR扩增, 使Tester dscDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增.

1.4 消减文库扩增及克隆分析

扩增产物与pGEM-T 载体连接, 转化JM109感受态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-T载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 证明含有插入片段后(200-1 000 bp), 测序. 应用生物信息学将测得序列与GenBank数据库进行同源性分析.

2 结果
2.1 mRNA的定性、定量分析

使用高质量的mRNA是保证cDNA高产量的前提. 紫外分光检测显示, 双环醇及DMSO处理的HepG2细胞mRNA分别为4.28 g和4.35 g, A260/A280 = 1.89. 1.0%琼脂糖凝胶电泳见 mRNA为大于0.5 kb清晰慧尾片状条带, 证实mRNA质优量足.

2.2 dscDNA两端连接效率检测

dscDNA与接头连接效率的高低是决定抑制性消减杂交成败的最关键步骤. 将连接有adaptor l和adaptor 2的两组dscDNA分别用不同的特异性引物(看家基因甘油三磷酸脱氢酶G3PDH引物)进行28个循环扩增, 产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定. 结果显示两组dscDNA扩增产物浓度相当, 说明dscDNA已与接头高效率连接.

2.3 cDNA消减文库消减效率的鉴定

分别以消减及未消减PCR产物为模板, 用G3PDH引物进行PCR扩增, 分别在18、23、28、33次循环结束时从体系中吸取5 L进行电泳鉴定. 结果显示: 与未消减组PCR产物相比, 消减组PCR产物中G3PDH基因产物大大减少, 说明所构建的消减文库具有很高的消减效率, 见图1.

图1
图1 消减效率分析结果. 1-4: 未消减组, 引物为G3PDH3'、5', PCR循环次数分别为18、23、28、33; 5-8: 消减组, 引物为G3PDH3'、5', PCR循环次数分别为18、23、28、33.
2.4 差异表达cDNA片段的扩增及克隆

杂交产物经两轮PCR扩增后, 菌落PCR扩增结果显示为200-1 000 bp大小不等的插入片段, 所获得的85个克隆中几乎均含有插入片段, 这些条带可能代表差异表达的基因片段, 见图2.

图2
图2 部分克隆(1-13)菌落PCR鉴定电泳图.
2.5 cDNA测序与同源性分析结果

随机挑选30个克隆测序, 与GenBank数据库进行初步比较. 应用生物信息学技术分析发现, 其余22个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(98%-100%), 共编码14种基因. 8个克隆为人染色体上的序列, 不与任何已知功能的基因同源, 关于他们的具体基因归属仍需进一步研究分析. 详细结果见下表1.

表1 阳性克隆与GenBank同源序列比较结果.
同源蛋白基因相同克隆数同源性
组蛋白H2A2100%
v-fos 转换效应蛋白 (Fte-1)1100%
翻译起始因子1100%
胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)1100%
羧肽酶N199%
真核翻译延长因子 12100%
铁蛋白重链多肽198%
伴侣蛋白10相关蛋白 (EPFP1)199%
根蛋白 (RDX)1100%
开心蛋白(yippee protein)199%
惟一锌指(OZF)基因199%
腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP)198%
线粒体蛋白398%-100%
核糖体蛋白598%-100%
人类染色体克隆898%-100%
3 讨论

百赛诺(双环醇片)是我国第一个有国际独立知识产权的国家一类新药. 双环醇对各种原因引起的肝损伤有明显的保护作用. 近年的研究发现: 双环醇可保护扑热息痛导致的急性肝损伤, 使肝脏能量代谢和磷脂代谢趋于正常, 并对损伤的线粒体功能有显著的保护作用[1]. 双环醇对刀豆蛋白A(Con A)引起的小鼠肝细胞核DNA损伤具有明显的保护作用[2]. Lu et al[3]通过对小鼠的研究发现, 双环醇可以通过提高肝细胞对黄曲酶毒素B1(AFB1)的解毒能力来对抗AFB1对肝细胞的毒性作用. 基于双环醇对肝细胞的保护作用, 目前双环醇广泛的应用于病毒性肝炎的治疗中. 国内研究提示: 双环醇对慢性丙型肝炎有很好的改善临床症状和降低转氨酶的作用, 长期服用, 无明显不良反应, 患者的耐受性好[4]. 此外, 双环醇还可剂量依赖性保护缺血-再灌注引起的血清丙二醛(MDA)及尿素氮(BUN)升高、肾还原型谷胱甘肽(GSH)含量降低, 同时可诱导谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的活性, 缓解由于缺血-再灌注损伤引起的线粒体膜流动性降低, 对肾缺血-再灌注损伤有保护作用[5].

抑制性消减杂交方法是近年发展起来的一项新的基因克隆技术, 与传统的方法比较, 具有实验周期短、易操作、可靠性高、假阳性率低等特点, 能有效地分离扩增低丰度特异表达的基因, 可以在较短的时间内获得较理想的实验结果. 我们将双环醇刺激肝母细胞瘤细胞系HepG2, 并以双环醇溶剂DMSO刺激的相同细胞系作为对照, 以2种细胞系中提取的mRNA为起始材料, 应用SSH方法成功地构建了双环醇激活相关基因差异表达的cDNA消减文库, 随机挑选30个克隆测序分析, 有22个克隆与已知功能的基因高度同源(98%-100%), 共编码14种基因. 8个克隆为人染色体上的序列, 不与任何已知功能的基因同源, 关于他们的具体基因归属仍需进一步研究分析.

14种已知功能的基因可分为3类: (1)与细胞结构、生长、增生相关的基因. 如线粒体蛋白、核糖体蛋白为细胞内结构的蛋白. 腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP)为广泛存在, 高度保守, 具有双重功能的蛋白质, 其氨基末端是细胞响应上游的RAS调节信号系统, 结合腺苷酸环化酶; 而羧基末端结合球形肌动蛋白, 改变微丝系统动态的重组, 是保持正常细胞形态和生长所需要的[6]. 根蛋白可将肌动蛋白丝连接到细胞质膜, 对细胞的运动、黏附、增生和保持细胞膜的完整性起到重要作用[7]. 根蛋白在肝脏中主要集中于胆管细胞膜上. 由于其支持多药耐药蛋白2(Mrp2)定位到胆管膜(BCM)上, 根蛋白对结合胆红素的分泌非常重要[8]. 也有研究提示他可能是人类自然杀伤(NK)细胞的一种特殊的生物学标记, 并且对NK细胞的功能可能起到特殊的作用[9]. v-fos 转换效应蛋白 (Fte-1): 编码参与蛋白输入线粒体功能的哺乳动物同源基因, 参与细胞周期循环[10]. (2)维持细胞稳定, 促进损伤细胞再生、修复的基因. 组蛋白H2A参与细胞转录激活、DNA修复、减数分裂和细胞凋亡等生物学作用. H2A羧基末端结构的改变可导致染色质稳定性和DNA折叠功能的改变[11]. 在细胞核内可保护常染色质免于异染色质的异位伸展的损害[12]. Fernandes et al[13]研究发现, 组蛋白H2A有较强的抗细菌感染作用. 铁蛋白重链多肽: 铁蛋白是体内主要储存铁的蛋白质, 与体内铁的代谢密切相关. 有研究发现肝脏中其水平的升高为抵抗氧化应激损伤的机制之一[14], 近来还有研究认为铁蛋白重链基因有抗凋亡作用, 可以使肝脏免受缺血性损伤[15]. 胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP-1) 在肝脏和子宫内膜大量表达, 调节胰岛素样生长因子(IGF)的生物利用度, 还可能通过对MAPK/ERK 和C/EBP信号系统的影响来支持肝细胞的再生[16]. 在肝脏中, IGFBP-1的转录被胰岛素抑制, 因此可以作为肝脏内胰岛素敏感度的指标. IGFBP-1的过表达可通过降低IGF-I 和/或IGF-II的促有丝分裂活性, 抑制肝脏肿瘤的形成[17]. 还有报道IGFBP-1抑制乳腺肿瘤细胞的活动[18]. 在II型糖尿病患者, 通过降低IGF对血管内皮细胞的潜在的促分裂作用, 血液循环中高水平的磷酸化的IGFBP-1可降低高血压病和心血管疾病的进展[19]. (3)锌指蛋白相关基因. 惟一锌指(OZF)基因: 编码10种锌指蛋白的基因, 在乳腺和胰腺肿瘤细胞中较正常细胞中要多[20-21]. 开心蛋白(yippee protein)是Roxstrom-Lindquist et al[22]克隆出的一种果蝇属蛋白, 在真核生物中高度保守, 广泛存在于各种动物的细胞内, 具有与锌结合的特性. 羧肽酶N(CPN)是由两个50 kD小亚单位和两个83 kD大亚单位组成的锌指样金属蛋白酶[23], 由肝脏产生[24], 也有人认为在胃、肺、肠、脾、肾也有表达[25]. CPN可以分离进入血流的激肽、血管舒张素、血小板因子这些有生物活性的多肽的羧基末端的精氨酸和赖氨酸残基[26-27]. CPN也可分离补体C3a和C5a羧基末端的精氨酸[28], 极大地减少C3a和C5a的诱导平滑肌舒张、血管舒张和白细胞趋化, 以及肥大细胞释放组胺的生物学活性.

通过对上述双环醇激活相关基因的分析, 我们发现应用双环醇刺激细胞后, 一些与细胞生长、增生、维持细胞稳定及促进损伤细胞再生、修复的基因表达增高. 这些基因的作用也与体内的信号转导系统、抗肿瘤形成机制有一定的作用, 提示双环醇在维持细胞稳定、促进损伤细胞修复及抗肿瘤形成方面可能有一定作用.

编辑: N/A

1.  李 烨, 戴 国炜, 李 燕, 刘 耕陶. 双环醇对扑热息痛引起小鼠肝脏能量代谢和线粒体功能障碍的影响. 药学学报. 2001;36:723-726.  [PubMed]  [DOI]
2.  赵 冬梅, 刘 耕陶. 双环醇对刀豆蛋白A所致小鼠肝细胞核DNA损伤的保护作用. 中华医学杂志. 2001;81:844-848.  [PubMed]  [DOI]
3.  Lu H, Li Y. Effects of bicyclol on aflatoxin B1 metabolism and hepatotoxicity in rats. Acta Pharmacol Sin. 2002;23:942-945.  [PubMed]  [DOI]
4.  姚 光弼, 计 焱焱, 周 霞秋, 王 勤环, 吴 婉芬. 双环醇治疗慢性丙型肝炎的临床研究. 中华医学杂志. 2002;82:958-960.  [PubMed]  [DOI]
5.  赵 冬梅, 孙 韬, 李 燕. 双环醇对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的保护作用. 药学学报. 2002;37:412-414.  [PubMed]  [DOI]
6.  Ksiazek D, Brandstetter H, Israel L, Bourenkov GP, Katchalova G, Janssen KP, Bartunik HD, Noegel AA, Schleicher M, Holak TA. Structure of the N-terminal domain of the adenylyl cyclase-associated protein (CAP) from Dictyostelium discoideum. Structure. 2003;11:1171-1178.  [PubMed]  [DOI]
7.  Hoeflich KP, Tsukita S, Hicks L, Kay CM, Tsukita S, Ikura M. Insights into a single rod-like helix in activated radixin required for membrane-cytoskeletal cross-linking. Biochemistry. 2003;42:11634-11641.  [PubMed]  [DOI]
8.  Kikuchi S, Hata M, Fukumoto K, Yamane Y, Matsui T, Tamura A, Yonemura S, Yamagishi H, Keppler D, Tsukita S. Radixin deficiency causes conjugated hyperbilirubinemia with loss of Mrp2 from bile canalicular membranes. J Hepatol. 2003;38:551-553.  [PubMed]  [DOI]
9.  Ramoni C, Luciani F, Spadaro F, Lugini L, Lozupone F, Fais S. Differential expression and distribution of ezrin, radixin and moesin in human natural killer cells. Eur J Immunol. 2002;32:3059-3065.  [PubMed]  [DOI]
10.  Lecomte F, Szpirer J, Szpirer C. The S3a ribosomal protein gene is identical to the Fte-1 (v-fos transformation effector) gene and the TNF-alpha-induced TU-11 gene, and its transcript level is altered in transformed and tumor cells. Gene. 1997;186:271-277.  [PubMed]  [DOI]
11.  Ausió J, Abbott DW. The many tales of a tail: carboxyl-terminal tail heterogeneity specializes histone H2A variants for defined chromatin function. Biochemistry. 2002;41:5945-5949.  [PubMed]  [DOI]
12.  Meneghini MD, Wu M, Madhani HD. Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell. 2003;112:725-736.  [PubMed]  [DOI]
13.  Fernandes JM, Kemp GD, Molle MG, Smith VJ. Anti-microbial properties of histone H2A from skin secretions of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Biochem J. 2002;368:611-620.  [PubMed]  [DOI]
14.  Erario MA, Gonzales S, Noriega GO, Tomaro ML. Bilirubin and ferritin as protectors against hemin-induced oxidative stress in rat liver. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2002;48:877-884.  [PubMed]  [DOI]
15.  Berberat PO, Katori M, Kaczmarek E, Anselmo D, Lassman C, Ke B, Shen X, Busuttil RW, Yamashita K, Csizmadia E. Heavy chain ferritin acts as an antiapoptotic gene that protects livers from ischemia reperfusion injury. FASEB J. 2003;17:1724-1726.  [PubMed]  [DOI]
16.  Leu JI, Crissey MA, Craig LE, Taub R. Impaired hepatocyte DNA synthetic response posthepatectomy in insulin-like growth factor binding protein 1-deficient mice with defects in C/EBP beta and mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase regulation. Mol Cell Biol. 2003;23:1251-1259.  [PubMed]  [DOI]
17.  Lu S, Archer MC. Insulin-like growth factor binding protein-1 over-expression in transgenic mice inhibits hepatic preneoplasia. Mol Carcinog. 2003;36:142-146.  [PubMed]  [DOI]
18.  Zhang X, Yee D. Insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) inhibits breast cancer cell motility. Cancer Res. 2002;62:4369-4375.  [PubMed]  [DOI]
19.  Heald AH, Siddals KW, Fraser W, Taylor W, Kaushal K, Morris J, Young RJ, White A, Gibson JM. Low circulating levels of insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) are closely associated with the presence of macrovascular disease and hypertension in type 2 diabetes. Diabetes. 2002;51:2629-2636.  [PubMed]  [DOI]
20.  Blottière L, Apiou F, Ferbus D, Guenzi C, Dutrillaux B, Prospéri MT, Goubin G. Cloning, characterization, and chromosome assignment of Zfp146 the mouse ortholog of human ZNF146, a gene amplified and overexpressed in pancreatic cancer, and Zfp260 a closely related gene. Cytogenet Cell Genet. 1999;85:297-300.  [PubMed]  [DOI]
21.  Puissant C, Lennaouar M, Le Chalony C, Goubin G, Houdebine LM. OZF gene expression in growing mouse and rabbit mammary gland and in rabbit mammary cells and Nb2 cells under prolactin action. Biochem Mol Biol Int. 1996;38:543-552.  [PubMed]  [DOI]
22.  Roxström-Lindquist K, Faye I. The Drosophila gene Yippee reveals a novel family of putative zinc binding proteins highly conserved among eukaryotes. Insect Mol Biol. 2001;10:77-86.  [PubMed]  [DOI]
23.  Levin Y, Skidgel RA, Erdös EG. Isolation and characterization of the subunits of human plasma carboxypeptidase N (kininase i). Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:4618-4622.  [PubMed]  [DOI]
24.  成 军, 李 莉. 清除乙型肝炎病毒的非细胞裂解机制. 世界华人消化杂志. 2002;10:73-76.  [PubMed]  [DOI]
25.  Sato T, Miwa T, Akatsu H, Matsukawa N, Obata K, Okada N, Campbell W, Okada H. Pro-carboxypeptidase R is an acute phase protein in the mouse, whereas carboxypeptidase N is not. J Immunol. 2000;165:1053-1058.  [PubMed]  [DOI]
26.  ERDOS EG, SLOANE EM. An enzyme in human blood plasma that inactivates bradykinin and kallidins. Biochem Pharmacol. 1962;11:585-592.  [PubMed]  [DOI]
27.  Belew M, Gerdin B, Lindeberg G, Porath J, Saldeen T, Wallin R. Structure-activity relationships of vasoactive peptides derived from fibrin or fibrinogen degraded by plasmin. Biochim Biophys Acta. 1980;621:169-178.  [PubMed]  [DOI]
28.  Bokisch VA, Müller-Eberhard HJ. Anaphylatoxin inactivator of human plasma: its isolation and characterization as a carboxypeptidase. J Clin Invest. 1970;49:2427-2436.  [PubMed]  [DOI]